Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
к полианионам очень сильно зависит от pH и при pH 3 примерно в 10 000 раз
выше, чем при pH 7. Это скорее всего связано с тем, что при pH 3
компоненты смеси амфолинов представляют собой цепочку из 4-5 про-
тонированных аминогрупп (разделенных диметиленовыми звеньями). Их
карбоксильные группы при таком pH практически не заряжены, что
способствует образованию прочных комплексов между амфолинами и
полиаминами. При pH 7 наблюдается изменение знака суммарного заряда
амфолинов, образующиеся анионные компоненты отталкиваются от отрицательно
заряженных полианионов (Righetti et al., 1978). Прочность связывания
амфолитов-носителей зависит также от природы, отрицательных
Рис. 4.16. ИЭФ полианионов в 5%-ном акриламидном геле, содержащем 2%
амфолинов pH 2,5-5 в отсутствие (справа) и в присутствии (слева) 8 М
мочевины. 1 -гепаоин А, 2 - гепарин В, 3 - гепарин В с частично
восстановленными карбоксильными группами, 4 - полигалактуроновая кислота,
5 - поли-глутаминовая кислота. Зоны обнаруживали с помощью окрашивания
толуиди-новым синим. (Righetti et al., 1978.)
Общие экспериментальные аспекты
325
зарядов, от плотности их распределения и пространственной ориентации в
полианионной цепи. В зависимости от этих факторов прочность образующихся
комплексов убывает в ряду поли-фосфаты>полисульфаты>поликарбоксилаты. Для
полианионов, содержащих однотипные заряженные группы, на прочности
связывания сказываются плотность распределения и пространственная
ориентация зарядов. Так, полиглутаминовая кислота образует более прочные
комплексы, чем полигалактуроновая. Для реализации сколь-нибудь прочного
связывания полианион должен содержать, вероятно, не менее шести
заряженных групп, что было продемонстрировано на примере
гексаметафосфата.
4. ИЭФ красителей. При фокусировании кислых красителей (в основном
содержащих от одной до четырех сульфогрупп) пришлось столкнуться с
явлениями такого же типа, что и при ИЭФ различных полианионов (Righetti,
et al., 1977). Это казалось странным, достаточно неожиданным и не очень
согласовывалось с интерпретацией, выдвинутой ранее для других случаев
артефактной гетерогенности. Однако на сегодняшний день уже ясно,\ что в
основе этого явления лежит тот же самый принцип комплексообразования.
Отличие заключается в том, что при ИЭФ красителей в роли основной
многозарядной цепи выступают сами молекулы амфолинов, с каждой из которых
могут связываться одновременно до четырех и даже пяти молекул красителя.
Более того, молекулы красителя могут образовывать поперечные сшивки между
амфолиновыми цепями, формируя таким образом пространственную сетку
агрегатов, склонных к преципитации в ходе фокусирования. И действительно,
даже при простом добавлении в пробирку с раствором какого-либо из
полианионов раствора амфолинов, подкисленного до pH 3, наблюдается
помутнение, а в отдельных случаях и выпадение осадка. То же самое
происходит и с растворами большинства из опробованных кислых красителей.
Само собой разумеется, что "неизоэлектрическая преципитация" такого рода
не происходит при подкислении до pH 3 растворов полианионов или
красителей в отсутствие амфолинов. Разрушить образующиеся комплексы можно
было только путем изменения диэлектрической проницаемости растворителя
или повышением температуры, а также одновременным изменением обоих
параметров. По силе диссоциирующего действия наиболее широко используемые
дезагрегирующие агенты [при одинаковой молярности] можно расположить в
ряд диметилформамид-тетраметилмоче-
вина>диметилсульфоксид>мочевина>формамид (см. рис. 4.5). Мы предположили,
что в основе агрегации лежит двухстадийный процесс. На первой стадии
образуется прочный, практически недиссоциирующий ионный комплекс между
амфолинами и моле-
326
Глава 4
кулами красителя. На второй стадии реализуются гидрофобные взаимодействия
между связанными молекулами красителя.
5. ИЭФ поликатионов. Из общих соображений представляется совершенно
естественным сделать следующий шаг и проверить, не могут ли аналогичные
явления происходить и на другом "полюсе" шкалы pH. И в самом деле, при
работе с poly (Arg) (Gianazza, Righetti, 1980) оказалось, что прочность
образующегося комплекса настолько велика, что после внесения этого
поликатиона со стороны анода в гель с предварительно сформированным
градиентом pH в процессе миграции к катоду он увлекает за собой
сфокусированные амфолины. Преципитация комплекса в виде размазанного
пятна происходит в диапазоне pH 7-8, т. е. там, где амфолиты-носители
могут существовать в форме анионов. Таким образом, искаженный профиль
распределения амфолинов может свидетельствовать о том, что происходит
комплексообразование рассмотренного типа. При этом важно знать, не
содержат ли образцы избыточного количества солей, которые также могут
заметно искажать профиль фокусирования амфолинов. Следует отметить, что
подобное комплексообразование характерно, по-видимому, только для poly
(Arg). Poly (Lys) образует очень слабые комплексы с ам-фолинамй, а
