Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
6.3. ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ НЕПЕРИОДИЧЕСКИХ СТРУКТУР
К настоящему времени заметное развитие получила группа методов цифрового процессинга изображений непериодических объектов, позволяющих исследовать пространственную структуру отдельных макромолекул или их комплексов. Как и в случае двухмерных кристаллов, пространственная структура непериодических объектов рассчитывается на основе параметров набора их наклонных проекций. Однако в данном случае для получения статистически достоверной модели пространственной структуры необходимо усреднить большое число исходных проекций или индивидуальных трехмерных синтезов. В принципе можно использовать два подхода. Первый из них состоит в съемке наклонных изображений отдельных выбранных частиц и последующем синтезе их трехмерных структур, усредняемых затем между собой. Второй подход основан на анализе изображений всех частиц на пленке-подложке. Благодаря неупорядоченной ориентации частиц при адсорбции на пленку-подложку их изображения представляют различные проекции одной структуры, т.е. являются "наклонными" относительно друг друга. Проведя сортировку изображений, усредняют одинаковые проекции и сформировывают из них "наклонную серию", описывающую пространственную структуру объекта. Если число проанализированных
203
проекций велико, трехмерный синтез дает уже статистически усредненную структуру белка.
Первым и чрезвычайно важным этапом работы является исследование проекционной структуры молекул. Именно особенности проекционной структуры позволяют выбрать дальнейшую стратегию изучения пространственной структуры объекта. Задача исследования проекционной структуры состоит в выборе типичных для данного объекта проекций, установлении их характерных размеров, формы и т.п. и, наконец, в получении проекционных карт, характеризующихся определенным разрешением. Для решения этой задачи необходимо прежде всего получить высококачественные изображения объекта. В настоящее время электронная микроскопия одиночных молекул и их ансамблей практически полностью основывается на методе негативного контрастирования. Разрешение изображений негативно-контрастиро-ванных препаратов не превышает 15-20 А. Поэтому целесообразно на одном из первых этапов цифровой обработки изображений провести их фильтрацию от шумов, обусловленных контрастированием. Отсутствие периодичности в изображении делает невозможным Фурье-фильт-рацию, применяемую в случае двухмерных кристаллов. При фильтрации непериодического изображения его Фурье-трансформанту умножают на так называемую фильтрующую функцию. Чаще всего используется двухмерная функция распределения Гаусса. Такая математическая операция позволяет плавно удалить из трансформанты коэффициенты Фурье, генерированные деталями изображения, размер которых меньше предельного разрешения. Поэтому профильтрованное изображение, полученное преобразованием Фурье его трансформанты, обычно характеризуется более высоким соотношением полезный сигнал/шум, что облегчает последующие стадии цифровой обработки.
Следующий этап работы состоит в классификации изображений, т.е. выявлении одинаковых (или очень сходных) изображений и объединении их в группы для усреднения. Классификация предполагает сравнение изображений для определения их соответствия друг другу. Объективной мерой соответствия двух изображений может служить их кросс-корреляционная функция. Поэтому корреляционный анализ является традиционным методом исследования изображений. Простейшим наглядным примером могут служить два одинаковых произвольных изображения, повернутых на разные углы относительно их центров. Совместив центры изображений и поворачивая одно из них относительно другого, рассчитывают зависимость коэффициента их кросс-корреляции от угла поворота. Изображения на рис. 1.72 таковы, что при повороте на каждые 90° они будут полностью совмещаться и коэффициенты кросс-корреляции будут иметь максимальное значение, т.е; равняться единице. На реальных микрофотографиях изображения никогда не бывают полностью одинаковыми, и эти коэффициенты всегда меньше единицы. Проводя корреляционный анализ, изображения можно не только вращать, но и сдвигать относительно друг друга (рис. 1.73). Величины коэффициентов корреляции в максимумах функции служат качественной мерой схожести изображения, а углы пово-
204
Рис. 1.72. Зависимость коэффициента кросс-корреляций К изображений S\ и S2 от угла поворота одного из них относительно другого
Рис. 1.73. Экспериментальный пример кросс-корреляционного анализа двух идентичных изображений (круглые отверстия)
а — две одинаковые непрозрачные "маски" с круглыми отверстиями помещают в пучок света и сдвигают в различные положения относительно друг друга; мерой позиционной корреляции является интенсивность света, проходящего через заштрихованную область; б — трехмерная диаграмма зависимости интенсивности проходящего света от величины сдвига верхней "маски"; максимум наблюдается при полном совмещении краев обоих отверстий
рота или сдвиги определяют взаимную ориентацию, в которой соо-тветствие изображений максимально.
