Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
Аналогичное исследование было проведено для мультимолекуляр-ной системы цитохром-с-оксидазы - терминального компонента дыхательной цепи всех аэробных организмов [615]. Субъединичный состав этого комплекса варьирует в зависимости от источника выделения. В митохондриях сердца быка он образован 12 субъединицами. Их молекулярные массы составляют: I - 57, II - 26, III - 30, IV - 17, V - 12,5 кДа, а для остальных эта величина лежит в диапазоне 5-10 кДа. Реконструкция трехмерной структуры (рис. 1.68) показывает, что по форме молекула напоминает букву Y, ее высота составляет 11 нм и она состоит из трех доменов. Два верхних (Mj и М2), но крайней мере, частично эк-
200
спонированы на внешней поверхности мембраны и расстояние между центрами их масс составляет 4 нм. Значительная часть массы третьего домена (С) экспонирована в цитозоль. Комбинирование этих результатов с многочисленными данными по химической модификации гидрофобными и гидрофильными соединениями, кросс-сшивающими реагентами и иммунохимического мечения позволило предложить топографическую модель структуры цитохром-с-оксидазы в мембране, представленную на рис. 1.69.
При электронно-микроскопическом исследовании разрешение может быть ограничено многими причинами, главными из которых являются степень упорядоченности кристаллов и способ их подготовки к микроскопированию. Обычно такие кристаллы легко разрушаются электронным пучком и их приходится заключать в тонкие пленки контрастирующего вещества. Подобная процедура увеличивает радиационную стабильность кристаллов, повышает контрастность изображений, но значительно ухудшает разрешение. Предельное разрешение в этих случаях определяется зернистостью контрастирующего вещества (или размером его кристаллов) и не превышает 15-20 А. В ряду объектов, исследованных методами трехмерной электронной микроскопии, следует выделить бактериородопсин. В галофильных бактериях этот белок, функционирующий как светозависимый "протонный насос", организован в так называемые пурпурные мембраны - участки клеточной мембраны, содержащие бактериородопсин в кристаллической упаковке. Другими словами, бактериородопсин функционирует в клетке в форме двухмерных кристаллов, которые могут быть выделены в высокочистом состоянии.
Уникальной особенностью таких природных кристаллов оказалась их очень высокая упорядоченность и радиационная стабильность. Последнее обстоятельство позволило провести их исследование без применения негативного контрастирования [610]. Методом электронной дифракции7 на таких кристаллах были определены амплитуды структурных факторов вплоть до разрешения 6-7 А в плоскости мембраны. Изображения неконтрастированных пурпурных мембран характеризуются низким контрастом (< 1%). Цифровая обработка их позволила рассчитать и значения фаз для этого набора структурных факторов. И хотя трехмерный набор данных, созданный в результате анализа "наклонных серий" изображений, имел разрешение в направлении нормальном к плоскости мембраны 14 А, реконструкция трехмерной структуры позволила описать не только внешнюю форму, но и внутреннее строение молекулы. Оказалось, что полипептидная цепь бактериородопсина, состоящая из 248 аминокислотных остатков, образует семь а-спираль-ных /лрянс-мембранных сегментов8 (рис. 1.70). При этом общая высота
7 Электронная дифракция - один из режимов работы электронного микроскопа, при котором отключают ток в объективной линзе, формирующей изображение объекта.
8 Достигнутое разрешение не позволяет визуализировать вторичную структуру полипептидной цепи. Конформация а-спирали была показана с помощью рентгеновской дифракции.
201
цитоплазма
Рис. 1.69. Модель молекулы цитохром-с-оксидазы с указанием возможного расположения образующих ее субъединиц
Рис. 1.70. Трехмерная модель элементарной ячейки кристалла бактериородопсина
соо"
Р и с. 1.71. Модель укладки полипептидной цепи бактериородопсина в мембране Заштрихованные области указывают на выявленные антигенные детерминанты
202
молекулы соответствует толщине липидной мембраны (~ 40 А), что указывает на то, что основная часть молекулы белка погружена в мембрану и лишь небольшие участки полипептидной цепи экспонированы на ее поверхностях. Такой вывод впоследствии удалось подтвердить с помощью методов ограниченного протеолиза и иммунохимичес-кого мечения с использованием моноклональных антител к синтетическим фрагментам полипептидной цепи (рис. 1.71).
Главным фактором, лимитирующим разрешение в описанном выше исследовании, являлось радиационное разрушение кристаллов в ходе съемки. В последние годы заметное развитие получили методы электронного микроскопирования при низких и сверхнизких температурах, которые позволяют многократно повышать радиационную устойчивость биологических объектов. Их использование для исследования кристаллов бактериородопсина дало возможность собрать экспериментальные данные до разрешения 3 А в плоскости, параллельной мембране [616]. И хотя в направлении, нормальном к этой плоскости, разрешение оказалось значительно хуже, реконструкция трехмерной структуры позволила выявить ряд тонких деталей структуры, таких, как локализация боковых цепей некоторых аминокислот и (3-иононового кольца ретиналя. Используя полученные данные как реперные точки и сведения о первичной структуре, удалось вписать полипептидную цепь в трехмерную карту белковой плотности и рассчитать атомную модель структуры белка.
