Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
197
Рис. 1.66. Трехмерная модель элементарной ячейки кристалла Na+,K+-АТРазы Предполагаемый мембранный фрагмент окрашен в темный цвет
превышает 40 кДа. Таким образом, 75% массы а- и (3-субъединиц распределены между вне- и внутриклеточным доменами протомера. По данным химического мече-ния флюорескамином соотношение масс этих доменов для а-субъ-единицы составляет 3:1. Полипептидная цепь (3-субъединицы экспонирована только на внеклеточной поверхности мембраны [582]. В соответствии с этим молекулярные массы гидрофильных доменов протомера на обеих мембранных поверхностях составляют около 50 кДа. В связи с тем, что общий объем протомера (170000 А3) соответствует 150 кДа, то на модели (рис. 1.66) эти домены образованы четырьмя верхними и четырьмя нижними сечениями. Пять сечений, расположенных в средней части, являются гидрофобным сегментом, и его высота (40 А) хорошо согласуется с обычной толщиной липидного бислоя.
Трехмерная структура с разрешением 20 А не позволяет установить взаимное расположение а- и (3-субъединиц в протомере. В таком случае для изучения субъединичной топографии может быть применен подход, состоящий в раздельном изучении пространственной структуры субъединиц и их сопоставлении со структурой молекулы фермента. С этой целью была выделена [3-субъединица Na+, К+-АТРазы и получены двухмерные кристаллы белка. Аналогично случаю полного фермента используемый препарат представляет собой мембранные фрагменты, содержащие (3-субъединицу в качестве единственного белка. Медленное охлаждение суспензии таких мембран до 4° в присутствии ионов Mg2+ или Са2+ приводит к формированию двухмерных кристаллов (рис. 1.53).
Поскольку кристаллизация полного фермента проводилась в присутствии ионов Mg2+, то для изучения структуры (З-субъединицы были выбраны кристаллы, формирующиеся в присутствии этого иона. Напомним, что параметры элементарной ячейки составляют: а = ПА, b = 177А и у = 63° и они относятся к плоской группе симметрии р21. Элементарная ячейка кристалла образована двумя основными областями, недоступными для контрастирующего вещества, и еще одной дополнительной областью, проходящей в виде непрерывной полосы через всю ячейку (рис. 1.53, а,б соответственно). Расчеты трехмерной структуры проводили для пространственной группы Р2, используя электронные микрофотографии кристаллов в диапазоне углов наклона ±60°. Трехмерная модель структуры двух основных недоступных для контрастирующего вещества областей (а на рис. 1.53) представлена на
198
Рис. 1.67. Трехмерная модель элементарной ячейки. Mg2+-(j)opMbi кристалла 13-субъединицы Na+,K+-АТРазы
Рис. 1.68. Трехмерная модель элементарной ячейки кристалла цитохром-с-окси-дазы
рис. 1.67 в виде сечений толщиной 6,5 А параллельных плоскости мембраны [585]. Если принять парциальный объем белка равным
1,3 А3/Да [610], то масса каждой такой области составит 40 кДа, что хорошо согласуется с молекулярной массой одной (3-субъединицы 35 кДа [612]. Дополнительный район (Ь на рис. 1.53) в трехмерной модели не представлен, так как он является, по-видимому, фрагментом липидного бислоя. Об этом свидетельствует его высота (40 А) и локализация вдоль с-оси трехмерной ячейки кристалла: в той ее части, где находятся гидрофобные домены (3-субъединиц (см. ниже).
Таким образом, в состав элементарной ячейки кристалла входят две [3-субъединицы. Особенностью их пространственной структуры
199
является выраженная асимметрия распределения массы вдоль направления, перпендикулярного плоскости мембраны. Иммунохимическим анализом участки полипептидной цепи (3-субъединицы удалось обнаружить только на внеклеточной мембранной поверхности [582]. По данным химической модификации Na+, К+-АТРазы в составе нативных мембран и "right-side-out" протеолипосом, организация (3-субъединицы в мембранах характеризуется значительной асимметрией: гидрофильные участки полипептидной цепи образуют один гидрофильный домен, экспонированный на внеклеточной мембранной поверхности [613]. На внутриклеточной поверхности по этим данным может находиться не более 10% молекулярной массы. Анализ профиля гидрофобности аминокислотной последовательности (3-субъединицы позволяет предположить наличие не более, чем четырех ее трансмембранных участков [612], что соответствует массе внутримембранного домена 10 кДа. Это хорошо согласуется с данными по химической модификации непроникающими реагентами и гидрофобному мечению [613, 614]. Таким образом, массы гидрофильного и гидрофобного доменов составляют соответственно 25 и 10 кДа. (Следует иметь в виду, однако, что такие расчеты массы для гидрофобного домена должны рассматриваться лишь как оценка "сверху", а для гидрофильного - как оценка "снизу"). В соответствии с такими оценками на модели (рис. 1.67) гидрофильный домен представлен восемью сечениями относительно широкой части модели, а остальные сечения образуют ее гидрофобный домен. Именно в этой части трехмерной элементарной ячейки кристалла расположен дополнительный район, недоступный для контрастирующего вещества (рис. 1.53,6) и являющийся, по-видимому, фрагментом липидного бислоя. Характерной особенностью структуры элементарной ячейки кристалла (3-субъединицы является отсутствие выраженных контактов между соседними молекулами. В случае Na+, К+-АТРазы а,(3-протомеры имеют область контакта, расположенную асимметрично относительно мембраны (рис. 1.66). Это свидетельствует о том, что образование димеров Na+, К+-АТРазы обусловлено взаимодействием а-субъединиц и область контакта находится на внутриклеточной мембранной поверхности, так как именно там экспонирована основная часть их молекулярной массы. Кроме того, сравнение трехмерных структур (3-субъединицы и а,(3-протомера (рис. 1.66 и 1.67) выявляет подобие гидрофильного домена (3-субъединицы и верхней части а,(3-протомера.
