Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 1.65. Схематическое изображение трансформанты Фурье двухмерного кристалла, представляющей собой решетку линий, перпендикулярных к плоскости кристалла
при негативном контрастировании, входят 4 или 8 протомеров. Это не позволяет сделать однозначное заключение о составе функционально активной молекулы токсина. Однако то обстоятельство, что минимальной структурной единицей, проявляющейся как для одиночных частиц, так и для двухмерных кристаллов, является тетрамер или октамер, говорит о том, что в растворе белок существует в виде олигомеров идентичных полипептидов. Более детальная информация об относительном расположении полипептидов и их пространственной структуре может быть получена после реконструкции трехмерной структуры молекулы по наклонным изображениям данных кристаллов.
Определение трехмерной структуры белков по данным электронного микроскопирования двухмерных кристаллов. Получение объекта исследования в форме двухмерных кристаллов создает хорошую предпосылку для определения его пространственной структуры. При этом разрешение, с которым в конечном итоге может быть рассчитана пространственная структура, определяется многими факторами. Главным является качество кристаллов; степень их упорядоченности, размеры, стабильность и др.
В отличие от плоской дифракции отдельного изображения полная дифракционная картина от трехмерного объекта представляет собой пространственную решетку. Для расчета трехмерной структуры с помощью Фурье-синтеза необходимо найти амплитуды и фазы рефлексов с индексами 1, не равными нулю. Это можно сделать, анализируя изображения, снятые в микроскопе при наклоне кристалла относительно оптической оси прибора. Напомним, что согласно теореме проектирования Фурье-трансформанта любого изображения является одним из центральных сечений трехмерной трансформанты [580]. На рис. 1,65 векторы а* и Ь* задают плоскость такого сечения в обратном пространстве, на которой находятся максимумы с индексами (h, к, о). Через максимумы можно провести линии обратной решетки, нормальные к этой поверхности, на которых и должны располагаться максимумы с индексами 1 = 0. Трансформанта наклонного изображения, являющаяся также центральным сечением, задает другую плоскость, пересекающую линии обратной решетки, и значения амплитуд и фаз
196
дифрагированных лучей в точках пересечения. Аналогичные операции со всей совокупностью наклонных изображений, снятых в максимально широком диапазоне углов наклона, позволяют провести много таких новых плоскостей и, следовательно, построить полную трехмерную трансформанту, т.е. определить амплитуды и фазы для всех узлов обратной пространственной решетки. Далее, используя полученную информацию, с помощью Фурье-синтеза, аналогично процедуре в рентгеноструктурном анализе, рассчитывают пространственную структуру как распределение рассеивающего электроны вещества в объеме элементарной ячейки кристалла.
Суммируя вышеизложенное, можно сказать, что исследование пространственной структуры двухмерных кристаллов состоит из нескольких этапов: 1) получение микрофотографий кристаллов в максимально доступном диапазоне углов их наклона относительно оптической оси микроскопа; 2) получение Фурье-трансформант изображений и их фильтрация от шумов; 3) комбинирование всех изображений для построения трехмерной трансформанты и определения структурных факторов; 4) Фурье-синтез пространственной структуры.
К настоящему времени для нескольких мембранных белков выполнены такие реконструкции трехмерной структуры. Показательным примером может служить Na+, К+-АТРаза почек свиньи. Как было показано в предыдущем разделе, Na+, К+-АТРаза может быть закристаллизована в нескольких различных формах. Для изучения трехмерной структуры наиболее подходящей является кристаллическая форма 2, поскольку в присутствии ионов Mg2+, V03 и К+ она является доминирующей и эти кристаллы обладают более высокой симметрией, чем, например, форма 1. Трехмерная реконструкция выполнена в пространственной группе Р2 на основе данных пяти независимых наклонных серий [609]. Полученная таким образом пространственная структура, представленная в виде параллельных плоскости мембраны сечений высотой 7,5 А, приведена на рис. 1.66. Элементарная ячейка образована двумя идентичными белковыми массами. Рассчитанный объем структуры составляет 340000 А3. Если принять парциальный объем белка равным 1,3 А3/Да [610], то молекулярная масса составит 260 кДа, что хорошо согласуется с молекулярной массой двух а,(3-протомеров (280 кДа) [611, 612]. Поскольку кристаллизация белка достигалась без полной солюбилизации мембран, протомеры имеют одинаковую ориентацию относительно плоскости мембраны.
Высота протомеров составляет 100 А, что значительно превышает обычную толщину липидных мембран. Поэтому следует ожидать, что значительная часть массы каждого протомера экспонирована на мембранных поверхностях. Анализ гидрофобности аминокислотных последовательностей а- и (3-субъединиц [611, 612], а также данные по гидрофильному и гидрофобному мечению белка в составе открытых мембранных фрагментов и "inside-out" протеолипосомах [609], показывает, что внутримембранный домен протомера образован не более чем 25%-ми массы каждой субъединицы и его суммарная молекулярная масса не
