Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
Традиционная стратегия корреляционного анализа электронно-микроскопических изображений основана на выборе из экспериментального набора профильтрованных изображений одного в качестве модельной проекции. По этой модели проводится ориентация остальных изображений и усреднение тех из них, максимальные коэффициенты корреляции которых с моделью достаточно высоки. Усредненную проекцию можно принять за новую модель и весь цикл анализа повторить заново. Описанная стратегия анализа эффективна в тех случаях, когда в силу особенностей структуры объекта количество возможных его ориентаций на пленке-подложке мало и соответствующие им изображения хорошо различимы визуально на микрофотографиях. Далее, используя ограниченное число визуально выбранных моделей, легко классифицируют все изображения и получают проекционную структуру объекта, усреднив изображения внутри классов.
Примером успешного применения такой стратегии служат результаты исследования быстрых натриевых каналов, полученных в очищенном виде после солюбилизации мембран электровозбудимых тканей [617]. Функционирование этих белков обеспечивает потенциалзависимое изменение ионной проницаемости мембран и, тем самым, прохождение электрических импульсов вдоль нервных волокон.
Визуальный анализ микрофотографии солюбилизированных препаратов (рис. 1.74) позволяет обнаружить два класса изображений
205
Рис. 1.74. Микрофотографии солюбилизированного препарата Na-каналов
Негативное контрастирование 2%-ным водным раствором уранилацетата. а — общий вид и 6 — частицы типа "квадрат” (вверху) и палочкообразные структуры {внизу) при большем увеличении, выбранные для анализа с помощью цифрового процессинга
Рис. 1.75. Усредненные проекции структуры Ыа-канала
а,в — проекции, выявленные и препаратах белка, реконструированных в липидные мембраны. 6 — проекция, выявляемая только в препаратах солюбилизированного белка
Ж
частиц: напоминающие по форме квадрат (рис. 1.74, а) и удлиненные палочкообразные (рис. 1.74, б). Тонкая структура этих частиц, выявляемая с помощью цифрового процессинга их изображений, представлена на рис. 1.75, а,б. Частицы типа "квадрат" представляют собой розеткообразные структуры. Аналогичные структуры наблюдаются также при исследовании препаратов быстрых натриевых каналов, реконструированных в липидные бислои. Однако в этом случае удается выявить и второй тип розеток меньшего размера (рис. 1.75, б). Поскольку два типа розеток характерны для мембранной формы белка, предполагают, что они являются проекциями его структуры и на внутриклеточную поверхность мембран. Палочкообразные частицы, обнаруживаемые только в солюбилизированных препаратах канала, представляют собой, по-видимому, его боковую проекцию.
Статистическую достоверность основных параметров полученных проекций удалось подтвердить с помощью кристаллографического подхода. Попытки получить двухмерные кристаллы натриевого канала не увенчались успехом. Однако были получены тонкие трехмерные кристаллы, проекционная структура которых была установлена методами электронно-микроскопической кристаллографии. Как видно из рис. 1.76, а, проекция на плоскость (h, к, о) содержит два типа структур, основные параметры которых совпадают с мембранными проекциями, выявленными корреляционным анализом (рис. 1.76, б), хотя и наблюдаются некоторые различия в количестве и высоте максимумов белковой плотности. Вместе с тем боковая проекция, выявленная корреляционным анализом, эквивалентна кристаллической проекции на плоскость (о, k, 1) [618]. Наличие трех главных проекций: двух мембранных и боковой, дает возможность представить натриевый канал в мембране в виде суженного в центральной части цилиндра, верхний и нижний диаметры которого неодинаковы (рис. 1.77). Высота канала (85 А), равная максимальному параметру боковой проекции, заметно превышает толщину липидного бислоя. Белок натриевого канала, являющийся функционально трансмембранным, пронизывает мембрану, и, по-видимому, значительная часть полипептидных цепей, образующих его, экспонирована на обеих мембранных поверхностях.
Обращает на себя внимание выраженное сходство проекционных структур белка натриевого канала и ацетилхолинового рецептора [619]. Геометрические параметры проекций несколько меньше в случае белка натриевого канала. Однако в обоих случаях мембранные проекции имеют розеткообразную форму, число пиков белковой плотности у них также одинаково. В центре розеток имеется область с пониженной плотностью. В ацетилхолиновом рецепторе эта область отождествляется с устьем ионного канала. Поскольку проекционные структуры обоих мембранных каналообразующих белков сходны, предложенные на их основе модели пространственной организации также имеют много общих черт (рис. 1.78) [620]. В случае ацетилхолинового рецептора правомерность построения моделей пространственной структуры на основе электронно-микроскопических проекций была
207
Рис. 1.76. Структура кристалла белка Na-канала в проекциях на плоскости
а — (h, к, о); б — (о, к, I)
подтверждена результатами изучения структуры этого белка в форме двухмерных кристаллов [621]. Не исключено, что сходство пространственной организации этих белков обусловлено близостью их первичных структур. Первичная структура белков натриевого канала из мозга крыс в настоящее время не установлена. Однако известна аминокислотная последовательность белка, ответственного за формирование натриевого канала в электроплаксах угря. Результаты сравнительного анализа этого белка и холинорецептора из Electrophorus
