Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
190
Рис. 1.61. Профильтрованное изображение двухмерных кристаллов реакционных центров
температуру, при которой проводился анализ, ионную силу, ионный состав, отношение липид/белок, pH, скорость диализа [600]. Наиболее существенными параметрами кристаллизации оказались температура (20°) и pH среды (8,0). Максимальный линейный размер кристаллов достигал 2 мкм. Относительное количество таких кристаллов от общего числа мембранных фрагментов в препаратах составляло ~ 50%. По данным Фурье-анализа и оптической дифракции разрешение на таких кристаллах достигает 2-3 нм. Фурье-синтез изображений кристаллов проводился для двухсторонней плоской группы pi. Отфильтрованное изображение негативно-контрастированного кристалла реакционного центра (четыре элементарные ячейки) представлено на рис. 1.61.
Элементарная ячейка имеет следующие кристаллографические параметры: а = 5,7 нм, b = 5,9 нм, у = 70°. Из рис. 1.61 видно, что в элементарной ячейке кристалла можно выделить два различных по размерам локальных максимума белковой плотности с расстоянием между их центрами 3 нм. Неодинаковость этих максимумов по размерам, с одной стороны, может быть обусловлена артефактами элект-ронно-микроскопического контрастирования (например, неравномерностью распределения контрастирующего вещества по кристаллу), с другой стороны, различной степенью экспонированности структурных единиц кристалла из плоскости (а, Ь) в случае, если каждый локальный максимум соответствует одной и той же структурной единице, имеющей одинаковую ориентацию относительно плоскости кристалла. Локальные максимумы плотности также могут отражать разную ориентацию структурных единиц кристалла относительно плоскости (а, b) или соответствовать различным структурным единицам.
Сравнение аминокислотных последовательностей L- и М-субъ-единиц Chi. aurantiacus и пурпурных бактерий [598, 599, 601-603] позволяет сделать вывод о высокой степени их гомологии. По данным
191
рентгеноструктурного анализа, гетеродимер из пурпурных бактерий, образованный L- и М-субъединицами реакционного центра, представляет собой цилиндр с эллиптическим поперечным сечением. Высота цилиндра 5 нм, большой и малый диаметры эллиптического сечения равны соответственно 6 и 4 нм [602]. Из сопоставления размеров эллиптического сечения гетеродимера и элементарной ячейки двухмерного кристалла реакционного центра следует, что на одну элементарную ячейку приходится один гетеродимер, состоящий из L- и М-субъединиц. Поскольку параметр Ь = 5,9 нм практически совпадает с большим диаметром сечения гетеродимера (6 нм), можно сделать вывод, что гетеродимеры в двухмерном кристалле плотно прилегают друг к другу своими гидрофобными поверхностями в направлении Ь, а в пространстве между ними в других направлениях находятся молекулы липида. Это может быть установлено, вероятно, при построении трехмерной модели кристалла. В дальнейшем представляется перспективным получение двухмерных кристаллов комплексов реакционных центров с другими компонентами фотосинтетической системы (например, с молекулами антенного аппарата) с целью изучения их надмолекулярной организации, как это было сделано, например, при изучении цитохром-редуктазы [604].
Еще один пример - аргиопининсвязывающий белок (АСБ), выделенный из мембран коры головного мозга. Молекулярная масса полипептидной цепи составляет ~ 68 кДа [605]. Двухмерные кристаллы получали диализом от детергента смеси АСБ и ДМФХ, солюбилизированных (З-О-октилгликозидом [606]. Средний продольный размер таких кристаллов составляет ~ 0,2 мкм, поперечный 0,05 мкм. Кристаллы представляют собой ленты двухмерных слоев, свернутые в трубы. Вероятно, при кристаллизации первоначально молекулы АСБ собираются в нитевидные структуры, которые далее ассоциируют друг с другом, образуя ленты двухмерных слоев. Такие ленты в свою очередь образуют трубообразные структуры, в дальнейшем уже не склонные к более высокой степени ассоциации. Элементарная ячейка имеет следующие кристаллографические параметры: а = 8,3 нм, b = 8,9 нм, у ¦ 99°.
Как отмечалось, разрешение на таких кристаллах составляло около
3 нм, т.е. меньше предельного разрешения метода негативного контрастирования, которое ограничено приблизительно 2 нм. Применение на первых этапах цифровой обработки изображений методов кросс-кор-реляционного анализа позволяет несколько повысить разрешение. Однако существенное увеличение разрешения можно ожидать при повышении степени упорядоченности кристаллов за счет дальнейшей оптимизации методов кристаллизации. Кроме того, двухслойность полученных кристаллов затрудняет как интерпретацию их проекционной структуры, так и дальнейшую работу по определению их трехмерной структуры.
Одной из общих особенностей двухмерных кристаллов различных мембранных белков является их полиморфизм, т.е. одновременное существование нескольких кристаллических форм. Изменение условий
192
s
100 нм
ШЧ
Л
а*
