Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
изображениях двухмерных кристаллов составляет ~ 2,8 нм. Элементарная ячейка имеет следующие кристаллографические параметры: а = 13 нм, b = 25 нм, у = 86°. Отфильтрованное от статистических шумов изображение негативно контрастированного двухмерного кристалла (проекция на плоскость мембраны) представлено на рис. 1.59. Незаполненные контрастером области, соответствующие белковым молекулам (негативное контрастирование белка), образуют характерные полосы в направлении вектора а. Известно, что одна из проекций Fr АТРазы, называемая фронтальной, имеет гексагональную форму с
188
Рис. 1.59. Профильтрованное изображение двухмерного кристалла FjFo-АТРазы (проекция на плоскости мембраны)
Окружностями выделены участки, соответствующие отдельным молекулам белка; а и Ъ — базисные векторы элементарной ячейки
Рис. 1.60. Альтернативные модели структурной организации двухмерного кристалла FiFo-АТРазы с одной (а) и двумя (б) молекулами белка на элементарную ячейку
70нм
поперечником -12 нм, а боковые проекции форму прямоугольника или параллелограмма с шириной в пределах 7,4-8 нм. Следовательно, каждая полоса состоит из выстроенных в один ряд молекул FiF0-АТРазы, причем периферические части Fj, по-видимому, контактируют друг с другом и ориентированы своими фронтальными сторонами параллельно поверхности мембраны.
Таким образом, молекуле АТР-синтетазы в проекции на плоскость мембраны соответствует область в виде круга диаметром - 12 нм, содержащая шесть максимумов белковой плотности вокруг полости, заполненной контрастером. Вклад в два из них (имеются в виду максимумы между соседними белковыми молекулами) вносится двумя молекулами АТР-синтетазы (рис. 1.59). По всей вероятности, отсутствие гексагональной симметрии является результатом заметных искажений в упаковке молекул Fj на плоскости мембраны (именно они ограничивают разрешение до - 2,8 нм). Не исключен и небольшой наклон фронтальной стороны F| относительно плоскости мембраны, вносящий свой вклад в нарушение гексагональной симметрии.
Из сопоставления размеров элементарной ячейки кристалла
189
(13 • 25,3 нм) с размерами фронтальной проекции БрАТРазы (12 • 12 нм) можно заключить, что на одну элементарную ячейку приходится одна или две молекулы АТР-синтетазы. В первом случае непрокра-шенная область двухмерного кристалла между соседними рядами из молекул АТР-синтетазы соответствует липидному окружению, а во втором - внутримембранной части F0 другой белковой молекулы, имеющей противоположную ориентацию в мембране. В соответствии с этим можно предложить две альтернативные модели структурной организации двухмерного кристалла: с одной или двумя молекулами АТР-синтетазы на одну элементарную ячейку (рис. 1.60). Первая модель предполагает асимметричное встраивание белковых молекул в липидный бислой: все периферические части F] расположены по одну сторону мембраны, образующей двухмерный кристалл. Согласно второй модели, встраивание происходит с обеих сторон липидного бислоя: на каждую элементарную ячейку кристалла приходится две противоположно ориентированные в мембране молекулы АТР-синтетазы.
Следует отметить, что в соответствии с первой моделью (рис. 1.59) должны существовать два типа проекционных изображений: вид двухмерного кристалла со стороны периферических частей Fj, приведенный на рис. 1.58, и совершенно отличный от него вид с противоположной стороны мембраны. Поскольку изображений, соответствующих последнему типу, обнаружить не удалось, предпочтение отдают второй модели. В ее пользу свидетельствует и тот факт, что только эта модель предполагает, что в двухмерном кристалле АТР-синтетазы упорядоченное расположение белковых молекул в липидном бислое обеспечивается их взаимодействием друг с другом как внутри белкового ряда, так и между рядами. Первое осуществляется за счет периферических частей Fi соседних молекул, а второе за счет внутримембранных частей F0. Последнее взаимодействие может иметь место только в случае второй модели, для которой расстояние между соседними белковыми рядами в
2 раза меньше, чем в первой модели, и составляет ~ 12,8 нм, что хорошо соответствует максимальному продольному размеру Fj (12 нм, см. [597]). Что касается первой модели, то, согласно ей, взаимодействие между соседними белковыми рядами осуществляется за счет липидного окружения. Маловероятно, что такие взаимодействия могут стабилизировать упорядоченное образование типа двухмерного кристалла.
Другим примером кристаллизации реконструкцией служат реакционные центры зеленых бактерий Chloroflexus aurantiacus. Этот мембранный белок, играющий ключевую роль в процессах бактериального фотосинтеза, образован двумя типами субъединиц - L и М с молекулярными массами 28 и 32 кДа соответственно [598, 599]. Для получения двухмерных кристаллов в исходную фракцию реакционных центров (РЦ) (10 мг РЦ/мл в 50 мМ Трис-НС1-буфера, pH 9,0, содержащего 0,1% ЛДАО) добавляли солюбилизированный фосфа-тидилхолин в соотношениях от 2:1 до 1:2 (по массе). Реконструкцию реакционных центров в двухмерные кристаллы осуществляли путем диализа от детергента. При этом варьировали следующие параметры:
