Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
176
Р и с. 1.51. Микрофотографии мембранных фрагментов Na+, К+-АТРазы
а — агрегированные молекулы; б-д —• агрегация молекул с образованием цепочек, рядов и кристаллических областей небольшого размера; е — двухмерный кристалл и оптическая дифракция от выбранного участка изображения
177
формации Ej. Этому эффекту способствует присутствие ионов калия в высокой концентрации.
Агрегация белковых частиц, индуцируемая снижением температуры, обусловлена, по-видимому, эффектом разделения фаз, связанным с переходом липидной фазы мембран из жидкокристаллического состояния в твердое. В подходящей среде кристаллы могут формироваться при инкубации мембран при пониженной температуре до нескольких градусов в течение 1—4 недель [583]. Оказалось, что качество кристаллов зависит не только от температуры и времени инкубации, но и скорости ее достижения. Наиболее эффективно ’’равновесное” охлаждение, при котором температура суспензии снижается от 37 до 0° в течение нескольких недель [584].
Таблица 1.13 Условия кристаллизации и температурная стабильность двухмерных кристаллов Na+, К+-АТРазы
Кристаллическая форма Лигаид КС1, мМ Температура*, °С
1 -VO3 0---150 0---6
2 1 100 0---3
2
1
3 -рс4~ 0 0---7
*У казан диапазон температур, при которых не происходит ухудшения качества
кристаллов в течение 2 недель.
В условиях, близких к оптимальным, содержание кристаллов может доходить до 50% от общего количества мембранных фрагментов, а их размер достигать 0,5 мкм. Оптимальные условия образования двухмерных кристаллов Na+, К+-АТРазы и их температурной стабильности приведены в табл. 1.13. Сопоставление электронных микрофотографий кристаллов, а также картин оптических дифракций и их профильтрованных изображений, показывает, что Na+, К+-АТРаза может кристаллизоваться в трех различных формах (рис. 1.52). Кристаллографические параметры элементарных ячеек кристаллов представлены в табл. 1.14. Минимальный размер элементарной ячейки характерен для кристаллов формы 1. На профильтрованных изображениях таких кристаллов видно, что элементарная ячейка содержит один пик плотности и образована, по-видимому, одним протомером (т.е. парой а, (З-субъ-единиц). Для двух других форм (2 и 3) характерно наличие двух основных максимумов плотности на одну элементарную ячейку кристалла. Площадь каждого из них соответствует площади, характерной для формы 1. Поэтому их элементарные ячейки образованы, по-видимому, парой а, (3-протомеров. Значение фаз дифракционных максимумов для кристаллов формы 2 и 3 близки к 0 или 180° (стандартное отклонение при уточнении фазового центра не превышало 17°), а на профильтрованных изображениях отчетливо прослеживается наличие поворотной
178
500 А
J I___I
Рис. 1.52. Микрофотографии (а) и их профильтрованные изображения (б) трех форм двухмерных кристаллов Na+, К+-АТРазы (I, 2, 3 соответственно)
оси второго порядка, перпендикулярной плоскости мембраны. Это дает основание отнести такие кристаллы к двухсторонней группе симметрии р21. Элементарная ячейка кристаллов формы 1 лишена дополнительных элементов симметрии, а фазы дифракционных максимумов имеют произвольные значения в диапазоне 0—360°. Поэтому подобные кристаллы характеризуются низшей из возможных симметрий — pi.
Аналогичное исследование было проведено также для (3-субъединицы Na+, К+-АТРазы [585]. (3-Субъединица, как и сам фермент, может быть также получена в виде изолированных мембранных фрагментов. Двухмерные кристаллы формировались при медленном (0,1 град/ч) ох-
179
лаждении таких мембран от 37 до 4° в среде, содержащей ионы Mg2+ или Са2+. Следует отметить, что для кристаллизации (3-субъединицы
присутствие ионов VOJ необязательно. Кроме того, эти кристаллы характеризуются большей температурной устойчивостью по сравнению с полным ферментом. По данным оптической дифракции и Фурье-анализа разрешение на микрофотографиях достигает 20 А. Профильтрованные изображения двух кристаллических форм, полученных в присутствии ионов Mg2+ и Са2+, представлены на рис. 1.53. Элементарные ячейки обоих типов кристаллов содержат по два одинаковых максимума
Таблица 1.14 Параметры элементарных ячеек двухмерных кристаллов Na+, К+-АТРазы
Кристаллическая форма
Ь, им
у, град
S*, нм
*5 — площ; кристалла.
5,9 7,0 111 38,5
7,2 12,3 77 86,0
5,6 16,6 89 92,8
