Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
6 В данном случае третий индекс — / равен нулю, так как дифракция получена от плоской решетки.
172
Рис. 1.46. Микрофотография участка высокоупорядоченного двухмерного кристалла цитохром-с-редуктазы и картина оптической дифракции (на вставке в углу)
Негативное контрастирование 1%-ным водным раствором уранилацетата. Калибровка — 0,1 мкм
Дифракционная Объект картина Изображение
Рис. 1.47. Схема оптического дифрактометра
С, О, S — линзы; М - микрофотография; D —• плоскость дифракционной картины; I — плоскость изображения
амплитудных и фазовых спектров (рис. 1.49), которые в цифровой форме подробно показывают распределение таких величин в районах узлов обратной решетки. Анализ спектров позволяет определить положение центров максимума (и, следовательно, уточнить параметры элементарной ячейки кристаллов), их форму и рассчитать величины амплитуд и фаз (структурных факторов). Используя полученные структурные факторы для повторного преобразования Фурье, рассчитывают
173
Рис. 1.48. Дифракционная картина, рассчитанная на ЭВМ с помощью преобразования Фурье, участка изображения двухмерного кристалла Na+, К+-АТРазы
Символы (.,+-/-А,В и др.) обозначают разные интенсивности дифрагированных лучей в соответствующих точках обратного пространства. Сплошные линии — обратная решетка, проведенная через более интенсивные дифракционные максимумы. Цифры в углах решетки — индексы Миллера (h и к)
профильтрованное изображение исходного кристалла, содержащее информацию только о периодической составляющей объекта (рис. 1.50).
Поскольку в каждом дифракционном максимуме содержится информация о всех элементах структуры изображения, фильтрация дает изображение одной элементарной ячейки кристалла, усредненное по всем ячейкам исходного непрофильтрованного изображения. Таким образом, статистическая достоверность изображения молекулы достигается автоматически в результате фильтрации благодаря кристаллической природе объекта. Поскольку такие изображения представляют собой проекции трехмерной структуры белков на плоскость, то уже на этом этапе исследования можно сделать некоторые заключения о пространственной организации объекта.
Двухмерная кристаллизация белков и проекционная структура кристаллов. Основная трудность в реализации описанного выше подхода состоит в том, что чрезвычайно редко белки in vivo существуют и функционируют в мембранах в виде двухмерных кристаллов. Обычно белок необходимо выделить из клетки, очистить до гомогенного состояния и сформировать из него двухмерный кристалл [581]. В подавляющем большинстве случаев двухмерной кристаллизации подвергают
174
У X 10 11 12 13 14 15 16 17 18
32 162 345 179 170 90 57 179 78 42
33 95 239 253 320 225 211 176 61 84
34 166 140 181 139 367 173 128 190 98
35 89 156 282 254 509 495 91 282 191
36 105 59 174 92 <?«*> 393 242 236 130
37 121 119 188 322 443 360 49 210 124
38 109 174 25 126 422 398 193 41 144
39 16 58 141 152 113 280 125 122 287
40 164 105 128 48 53 152 132 216 219
х 10 11 12 13 14 15 16 17 18
У
32 1 26 22 2 34 17 27 11 33
33 34 2 24 11 30 33 35 6 17
34 31 3 34 5 12 22 17 26 36
35 1 10 35 32 31 1 35 33 14
36 4 15 35 3 0 32 9 33 15
37 9 31 13 23 29 18 22 19 12
38 18 0 16 12 35 5 24 10 23
39 24 24 25 12 11 3 24 34 5
40 26 20 28 17 3 35 1 22 8
Рис. 1.49. Амплитудный (вверху) и фазовый (внизу) спектры участка дифракционной карты вблизи максимума (0,1) на рис 1.48
Верхняя горизонтальная строка х и левый столбик цифр у — координаты обратного пространства. Центр дифракционного максимума обведен кругом, цифры внутри прямоугольников — распределение интенсивностей и фазовых углов дифрагированных лучей в непосредственной близости от центров максимумов
интегральные мембранные белки. Такие кристаллы могут формироваться либо в ’’нативном” липидном окружении, либо после (в ходе) их реконструкции в липидные бислои подходящего состава.
Кристаллизация мембранных белков может быть реализована в том случае, когда белок удается очистить до гомогенного состояния без солюбилизации содержащих его мембран в детергентах. Именно к таким белкам относится Na+, К+-АТРаза наружного мозгового слоя почек млекопитающих, в частности свиньи. Этот фермент, являющийся натриевым насосом клетки и обеспечивающий создание трансмембранного градиента концентраций ионов натрия и калия, состоит из двух типов субъединиц а и (3, присутствующих в эквимолярных коли-
175
Рис. 1.50. Проекционная структура двухмерного кристалла цитохром-с-редуктазы, полученная Фурье-фильтрацией участка изображения, аналогичного приведенному на рис. 1.46
чествах. Молекулярные массы а- и (3-субъединиц составляют 112 и 45 кДа соответственно [582].
При электронном микроскопировании мембранных фрагментов, содержащих очищенную Na+, К+-АТРазу, последняя выявляется в виде хаотично расположенных на поверхности мембран глобулярных частиц. Часто из-за эффектов латеральной диффузии происходит агрегация этих частиц и определенные участки мембраны содержат плотно упакованные молекулы (рис. 1.51). Такая агрегация частиц может быть инициирована внешним воздействием, например, инкубацией мембран при пониженной температуре [583]. В определенных условиях агрегация частиц имеет упорядоченный характер: наблюдается образование цепочек, ассоциация их между собой и формирование микрокристаллических областей. Для формирования двухмерных кристаллов большей площади необходимо тщательно оптимизировать условия кристаллизационного эксперимента. Na+, К+-АТРаза относится к так называемым Е^г-ферментам, т.е. может находиться в двух конформационных состояниях. Для кристаллизации необходимо стабилизировать белок в одной из этих конформаций, что достигается добавлением в среду инкубации соответствующих лигандов. Известно, что анионы ванадиевой и фосфорной кислот стабилизируют Na+, К+-АТРазу в кон-
