Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Попов Е.М. -> "Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка" -> 82

Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.

Попов Е.М. Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка — М.: Наука, 1996. — 480 c.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка): problemabelkat21996.djvu
Предыдущая << 1 .. 76 77 78 79 80 81 < 82 > 83 84 85 86 87 88 .. 232 >> Следующая

У --- параметры элементарной ячейки
плотности (а) и дополнительную область, недоступную для контрастирующего вещества (Ь). (Более подробно это будет рассмотрено при обсуждении трехмерной структуры кристаллов). Поскольку значения фаз дифракционных максимумов на Фурье-спектрах кристаллов близки к 0 или 180°, а на профильтрованных изображениях отчетливо прослеживается наличие поворотной оси второго порядка, то обе формы кристаллов по типу симметрии следует отнести к двухсторонней плоской группе р21.
Липидный состав мембран и их физико-химические свойства, по-видимому, могут решающим образом повлиять на результаты кристаллизации. Поэтому описанный выше подход не является универсальным. Так, например, для мембран дисков сетчатки глаза быка, содержащих в качестве основного белка (> 90%) родопсин, применение подобной технологии в широком диапазоне условий (pH, состав среды и т.п.) не привело к образованию кристаллов. Вместе с тем, модификация липидной фазы путем экстракции части липидов обработкой детергентом Твин-80 аналогично тому, как это было сделано в работе [586], позволила с помощью медленного охлаждения получить кристаллы. Микрофотография и профильтрованное изображение одного из таких кристаллов приведены на рис. 1.54. Кристаллы характеризуются симметрией р4 и их элементарные ячейки (параметры а = b = 87 А, у = 90°) образованы четырьмя молекулами родопсина, организованными в димеры. Качество таких кристаллов довольно высокое: разрешение 25 А. Однако их относительное количество не превышает нескольких процентов от общего содержания мембран [587].
Для мембранных белков наиболее перспективной является, по-видимому, кристаллизация реконструкцией делипидизированного белка
180
Рис. 1.53. Профильтрованные изображения кристаллов 3-субъединицы Na+, К+-АТРазы, полученных в присутствии ионов Са2+ (а) и Mg2+ (б)
в бислой определенного липидного состава [588, 589]. Широких систематических исследований по двухмерной кристаллизации мембранных белков до настоящего времени не проведено. Поэтому эмпирический подход все еще является основным. Однако результаты, полученные в ходе изучения нескольких мембранных белков, позволяют выделить ряд факторов, влияющих на формирование кристаллов. В общем случае кристаллизация реконструкцией является более многопараме-торным процессом, чем в случае кристаллизации без полной солюбилизации мембран. В зависимости от условий реконструкция белков в липид может приводить к образованию различных структур: много- и однослойных протеолипосом, трубчатых структур, плоских мембран. Наиболее удобны для электронно-микроскопического изучения плоские мембраны. Необходимо также, чтобы реконструированный в такие мембраны белок имел "плотную упаковку". Для получения требуемых структур определяющими являются выбор липидов и детергента, концентрация белка и количественное соотношение липид/ белок. Так, при использовании "жидких" липидов варьирование этого соотношения может приводить к появлению всего спектра упомянутых выше структур. Для получения кристаллов обычно приходится проводить изучение влияния на характер упаковки белков в мембранах и таких параметров, как pH, ионная сила, наличие многовалентных ионов. В некоторых случаях необходимо также присутствие специфических лигандов, стабилизирующих белок в одном из конформационных состояний. Существенное влияние могут оказывать также температура и скорость процесса реконструкции, т.е. удаления детергента.
Одним из примеров такого подхода может служить исследование процессов реконструкции в липидные бислои F^Q-АТРазы (АТР-синте-тазы) митохондрий [590, 591]. Митохондриальная FjF0-ATPa3a состоит из двух основных компонентов: мембранной (F0) и периферической (Fj) частей [592]. Субъединичная топография FjFo-АТРазы к настоящему времени практически не изучена, поэтому разработка методов получения всего комплекса в форме мембранных образований, пригодных для таких исследований, является актуальной. Для демонстрации объема работы, которую зачастую приходится проводить в ходе таких
181
Рис. 1.54. Микрофотография и картина оптической дифракции от выбранного участка двухмерного кристалла родопсина
Негативное контрастирование 2%-ным водным раствором ура-нилацстата
исследований, в табл. 1.15 представлены параметры и диапазоны их изменений в экспериментах по реконструкции F^o-АТРазы. В результате было установлено, что в зависимости от выбранных условий реконструкции образуются четыре типа белково-липидных структур: протеолипосомы - замкнутые липосомы со встроенными белковыми молекулами (рис. 1.55); мембранные фрагменты - незамкнутые липидные бислои со встроенными белковыми молекулами (рис. 1.56); нитевидные структуры - белковые образования, возможно, включающие в свой состав и липидные молекулы, в которых молекулы FiFo-АТРазы располагаются преимущественно в одном направлении, образуя нити (рис. 1.57) и двухмерные кристаллы - плоские липидные бислои с упорядоченно встроенными молекулами F]F0-ATPa3bi (рис. 1.58). Кроме того, в препаратах обычно присутствуют отдельные молекулы F|F(r АТРазы, фрагменты молекул, чисто липидные мембраны и липосомы, а также аморфный осадок. Содержание подобных образований может
Предыдущая << 1 .. 76 77 78 79 80 81 < 82 > 83 84 85 86 87 88 .. 232 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed