Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
182
Таблица 1.15
Диапазоны изменения параметров в экспериментах по реконструкции FjF0-АТРазы
Параметр Диапазон
изменения
Концентрация белка 1-3 мг/мл
липида 1-3 мг/мл
детергента 0,15-0,3%
Состав буфера для диализа 50-150 мМ
СНзСООЫа или Трис-НС1
NaCl 50-150 мМ
MgCl2 5-20 мМ
NaH2P04 0-5 мМ
pH среды 3,0-8,5
Температура 5-25°
Продолжительность 12-48 ч
составлять от 20 до 90% от общей массы препарата и зависит от чистоты и качества препаратов белка и липида, используемых при реконструкции. Как правило, исследуемые препараты содержат несколько типов структур, например, протеолипосомы и мембранные фрагменты одновременно. Их относительное содержание зависит от конкретных параметров эксперимента по реконструкции: соотношения липид/ белок/детергент, pH, ионной силы среды, наличия многовалентных ионов, природы используемых липидов и детергентов, а также температуры.
В качестве детергента были опробованы: N, Ы-диметилдодециламино-Ы-оксид (лаурилдиметил-аминоксид, ЛДАО), п-(трет-октил)фениловый эфир полиэтиленгликоля (тритон X-100), 3-[3-холамидопропил)-диметиламмоний]-пропансульфо-нат (ЧАПС, фирменное название по первым буквам английского названия детергента) и октил-О-глюкопиранозид (октилглюкозид). Оказалось, что использование тритона Х-100 нецелесообразно, так как детергент имеет низкую критическую константу мицеллообразования (~ 0,25 мМ) и плохо удаляется диализом. Поскольку при этом время проведения диализа увеличивается до 48 ч, то происходит частичная денатурация белка, что делает невозможным упорядоченное расположение молекул F]F0-ATPa3bi в липидном бислое. В таких условиях образуются только протеолипосомы и мембранные фрагменты. При сокращении времени проведения диализа детергент удаляется неполностью, что приводит к образованию многослойных мембранных структур с расстоянием между слоями около 5 нм. Сравнение характерных размеров таких структур с размерами Fi-АТРазы (12-12-7,4 нм) [593] указывает на то, что они не содержат молекул FjFo-АТРазы и их следует отнести к исключительно липиддетергентным образованиям. Аналогичные структуры были выявлены и при проведении реконструкции с ЛДАО, когда детергент удаляется не полностью (через 8-12 ч после начала диализа). По-видимому, отмеченные многослойные структуры являются промежуточными перед образованием как чисто липидных мембранных фрагментов, так и мембранных фрагментов со встроенными молекулами F^Q-АТРазы: при последующем понижении концентрации детергента происходит замыкание малых бислойных участков таких структур в единую мембрану и встраивание молекул F^Q-АТРазы в липидный матрикс. Более перспективным было использование для реконструкции FiF0-ATPa3bi ЧАПС и октилгликозида, критические
183
Р и с. 1.55. Микрофотография однослойной протеолипосомы
Рсконструкциоиная система соевый фосфатидилхолин—ЛДАО—FjFQ-АТРазы в соотношении 1:1:1 (по массе), pH 6. Контрастирование 0,11%-ным водным раствором уранилацетата. Стрелки указывают на одиночные молекулы FiFQ-АТРазы. Калибровка — 0,1 мкм
константы мицеллообразования которых равны соответственно 1,4 и 25 мМ [594, 595]. В данном случае имеет место хорошее встраивание интактного белкового комплекса в липидный бислой, однако двухмерные кристаллы и нитевидные структуры в таких условиях получить не удалось. Вероятно, это связано с индивидуальными особенностями структур соответствующих детергент-липид белковых мицелл.
В качестве липида, кроме фосфатидилхолина из соевых бобов (СФХ), использовали: яичный фосфатидилхолин (ЯФХ) и синтетический димиристоилфосфатидилхолин (ДМФХ). Встраивание F]F0-ATPa3bi в бислой из ЯФХ имеет место, однако образование двухмерных кристаллов и нитевидных структур обнаружено не было. Возможно, это связано с меньшей подвижностью молекул ЯФХ в образующемся бислое по сравнению с СФХ (температуры фазового перехода гель - жидкий кристалл для ЯФХ и СФХ близки к 0°, но для ЯФХ она немного выше) и согласуется с тем, что использование ДМФХ (температура фазового перехода 23°) приводило к образованию больших мембранных фрагментов с отдельно встроенными молекулами F|F0-ATPa3bi. Кроме того, в данном случае существенно возрастала доля чисто липидных образований: мембранных фрагментов, не содержащих белковых молекул, и липосом. Поскольку эксперименты по реконструкции проводили при комнатной температуре (~ 20°), при которой ДМФХ находился в относительно жестком гелеобразном состоянии, то, по-види-
184
щ
В88
Рис. 1.56. Микрофотографии мембранных фрагментов, полученных в той же конструкционной системе, что и на рис. 1.55, но при pH 4,5
а — проекция в плоскости мембраны; б — латеральная проекция; в — общепринятая модель FjFq — АТРазы в липидной мембране. Контрастирование 0,1%-ным водным раствором уранилацетата. Стрелки указывают на отдельные молекулы белка. Калибровка -0,1 мкм
