Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
162
ному замещению метионина на селенометионин. Уровень замещения в данной работе составил 92%. Структура гонадотропина после частичного дегликозилирования идентифицирована с разрешением 2,6 А. Использовались дифракционные данные, полученные методом МАД. Кристаллический образец облучался четырьмя длинами волн синхротронной радиации. Две из них (~ 0,98 А) находились на краю и пике поглощения Se, а две другие в стороне от полосы поглощения. Для каждой длины волны были получены ориентировочные значения дисперсионной (/’') и абсорбционной (f) компонент аномального рассеяния.
В работе Дж. Смит и соавт. метод МАД использован для определения пространственной структуры регуляторного аллостерического фермента глутамин-5-фосфорибозил-1-пирофосфат (РКРР)-аминотранс-феразы [567]. Белок состоит из 465 аминокислотных остатков и атома Fe, который является аномально рассеивающим центром при облучении тремя длинами волн (1,7425, 1,7390 и 1,5000 А) синхротронного излучения. В кристалле PRPP-аминотрансфераза обнаружена в виде гомотетрамера (молекулярная масса -200 кДа). В предшествующих рентгеноструктурных анализах с применением метода аномальной дифракции объектами исследования были белки, молекулярные массы которых не превышали 30 кДа. Данная работа свидетельствует о больших возможностях МАД в определении трехмерных структур громоздких белковых комплексов.
* * *
Рассмотренные в этой главе исследования, по-видимому, не оставляют сомнений в том, что в 1990-е годы рентгеноструктурный анализ белков, по-прежнему сохраняя высокий темп экстенсивного развития, приступил к решению принципиально новых задач, представляющих первостепенный интерес для молекулярной биологии. Основная, если не единственная, причина наметившегося качественного изменения возможностей кристаллографии макромолекул связана с использованием синхротронной радиации. Переход к новому источнику рентгеновского излучения, во-первых, ослабляет требования, предъявляемые к размерам кристаллов, что особенно важно в структурном анализе высокомолекулярных белков и их комплексов, имеющих крупные элементарные ячейки. Во-вторых, сплошной спектр синхротронной радиации и легкость выбора любой длины волны монохроматического излучения дали возможность по-новому подойти к решению фазовой проблемы и разработать метод мультидлинноволновой аномальной дифракции, требующий для фазирования одного кристаллического образца. Существенным дополнением метода МАД стал способ рекомбинантного получения в ауксотрофных клетках белков, в аминокислотных последовательностях которых все остатки метионина заменены на селенометионин. Использование [Se-Met] белков не только освобождает рентгеноструктурный анализ от длительной рутинной процедуры приготовления нескольких изоморфных белковых производных тяжелых атомов, но практически снимает саму проблему изоморфизма.
6* 163
И наконец, в-третьих, самое важное, применение в кристаллографии белков синхротронной радиации, несравненно более мощной, чем излучение рентгеновской трубки, снижает по крайней мере на два-три порядка время экспозиции. Значение этого факта трудно переоценить, так как становятся доступными для установления трехмерных структур на атомном уровне промежуточные соединения процессов жизнедеятельности. Если до недавнего времени рентгеноструктурный анализ являлся фактически единственным прямым методом исследования нативных конформаций белковых молекул с атомным разрешением, то сейчас он становится источником (также единственным) столь же детальной информации о пространственном строении промежуточных соединений.
Таким образом, ближайшие перспективы развития рентгеноструктурного анализа белков будут определяться достижениями в использовании синхротронной радиации в трех отмеченных направлениях: синтезе и кристаллизации белков, а также условиях проведения эксперимента. Продолжится наметившееся сближение рентгеноструктурного анализа белка с методами малоуглового рассеяния, флюоресценции, криомикроскопии, лазерной, ЯМР- и УФ-спектроскопии и т.д. Сделанные прогнозы касаются кумулятивного развития кристаллографии белка и, следовательно, говорят о его тактических целях. Что же касается стратегического прогноза, то он не может быть известен, поскольку развитие науки, являясь нелинейным неравновесным процессом, не имеет конечной цели и непредсказуемо в принципе.
Глава 5
НЕЙТРОННАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ БЕЛКОВ
Два десятилетия (1960—1970-е годы) рентгеноструктурный анализ был единственным методом прямого исследования пространственного строения белков. Его роль и сейчас остается доминирующей. Однако в начале 1980-х годов появились новые методы, дополняющие рентгеноструктурный анализ. Они основаны на применении в кристаллографии белков дифракции нейтронов и гамма-лучей. Эти методы сходны с рентгеноструктурным анализом прежде всего использованием одного и того же состояния исследуемого образца — это также белковый монокристалл и изучаемым явлением — дифракцией, но дифракцией уже других излучений. Явления, происходящие во взаимодействии атомов, упорядоченных в кристаллической решетке молекул белков, с нейтронами и гамма-излучением, сильно отличаются друг от друга и от того, что имеет место при взаимодействии атомов с рентгеновским излучением. Поэтому получаемые от трех методов дифракционные картины не полностью совпадают между собой, а дополняют друг друга, раскрывая новые свойства белковых молекул. Рентгеновские лучи рассеиваются электронной плотностью. Рассеивающая 164
