Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
Таким образом, в работе [504] экспериментально подтвержден двухступенчатый механизм реакции галоалкандегалогеназы, предложенный ранее [522]. В каталитической реакции этого фермента, протекающей в условиях in vivo, время жизни промежуточных продуктов слишком коротко для проведения кристаллографического исследования. Авторам удалось путем изменения pH и температуры замедлить процесс, разделить его на две стадии и изучить атомные трехмерные структуры с разрешением 2,0-2,4 А и R-фактором 16, 5-19, 5% соответствующих фермент-субстратных комплексов. Показано, что центральную роль на первой стадии алкилирования играет в качестве нуклеофила карбоксильная группа остатка Asp-124, а на второй стадии деалкилирования - молекула воды, атакующая центральный атом углерода сложноэфирной группы ковалентного промежуточного соединения.
Деацилирование трипсина. Аналогичное по своей направленности исследование одновременно было проведено П. Зингером и соавт.: с классическим в энзимологии объектом, трипсином [500]. Использован кристаллографический метод Лауэ с временным разрешением и полихроматическим синхротронным излучением.
Трудами многих исследователей, прежде всего М. Бендера и В. Дженкса, уже давно была разработана химическая схема каталитического акта сериновых протеиназ, в том числе трипсина [523-525]:
E+S ^ E S ES* ^ ЕА ^ ЕА * ** Е А ? Е+Р2
+
Pi
I II III IV V VI VII
Механизм триптического гидролиза, согласно предложенной схеме, включает последовательную цепочку химических стадий взаимодействия фермента и субстрата, протекающих через ковалентные промежуточные состояния. Каталитический процесс начинается с образования невалентного комплекса Михаэлиса (П), в котором гидроксил Ser-195 и имидазольное кольцо His-57 фермента оказываются сближенными соответственно с карбонильной и амидной группами расщепляемой пептидной или сложноэфирной связи субстрата. В результате их согласованных взаимодействий невалентное фермент-субстратное связывание переходит в ковалентное с образованием сначала малоустойчивого промежуточного соединения так называемого тетраэдрического аддукта (III). Последний распадается на ацилфермент и амин (IV), а при гидролизе сложного эфира на ацилфермент и спирт. Далее следует деацилирование, которое проходит в принципе аналогичным образом, но в обратном порядке и с участием в качестве нуклеофильного агента не атома Оу боковой цепи Ser-195, а молекулы воды. Вновь образуется метастабильный тетраэдрический аддукт (V),
150
распадающийся, проходя стадию невалентного комплекса (VI), на исходный фермент и второй продукт реакции (VII). Химический механизм действия протеолитических сериновых ферментов был разработан до появления результатов рентгеноструктурного анализа пространственного строения их молекул.
Кристаллографическая структура нативного трипсина с разрешением 1,8 А, позднее уточненная до 1,5 А, была установлена Р. Штраудом и соавт. [526-528], а также Р. Хубером, В. Боде и соавт. [529-531]. Геометрия активного центра идентифицирована на основе результатов рентгеноструктурного анализа комплексов трипсина с белковыми ингибиторами животного и растительного происхождения [532-534] и необратимыми синтетическими ингибиторами [535]. Показано, что во взаимодействии с субстратом и при образовании промежуточных продуктов катализа непосредственно участвуют гидроксильная группа остатка Ser-195 и имидазольное кольцо His-57, которые расположены на поверхности белковой глобулы и образуют водородную связь Ne2...H-01'. Остаток His-57 сближен также с Asp-102, и между ними реализуется взаимодействие №]-Н...0^2.
Вернемся теперь к работе Зингера и соавт. [500], в которой с помощью рентгеновской дисЬракции синхротронного излучения изучен механизм действия трипсина на второй стадии каталитического акта (IV-VII). Исследование началось с приготовления устойчивого промежуточного соединения ферментативной реакции ацилфермента (VI) путем присоединения я-гуанидинбензоата (GB) к Ser-195 трипсина, находящегося в кристаллическом состоянии в маточном растворе при pH 5,5. При быстром повышении pH до 8,5 возникал процесс, который контролировался методом трехмерной Лауэ-кристаллографии. Дифракция рентгеновских лучей фиксировалась при трех сериях облучений различных участков кристаллического образца с пятисекундной экспозицией одной съемки в каждой серии. Первая серия экспозиций проведена до впрыскивания в проточную ячейку буферного раствора при pH 8,5, а вторая и третья серии соответственно через 3 и 90 мин после (to, t3, t). Пространственные структуры трех фермент-субст-ратных комплексов расшифрованы с разрешением 1,8 А и R-факторами расходимости около 20%. Средние различия между координатами атомов этих структур приведены в табл. 1.11. Сопоставление структур до и после повышения pH показало, что одна из находящихся в активном центре фермента молекул воды предрасположена к атаке ацильной группы на стадии инициации гидролиза ацилфермента и по ходу реакции обнаруживает тенденцию к сближению с карбонильным углеродом. Таким образом, декларация об участии воды в процессе деацилирования трипсинового промежуточного продукта превращается из вероятного предположения М. Бендера, В. Дженкса и Д. Блоу в экспериментальный факт.
