Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
‘ Авторы метода использовали его для получения двух тиоредокси-нов клеток Т4 и Е. coli со стопроцентной заменой метионина на селено-метионин. Кристаллы [Se-Met]-замещенных тиоредоксинов оказались полностью изоморфными природным рекомбинантным белкам. Дифрак-
160
Рис. 1.43. Факторы аномального рассеяния f, f" кристалла селенометионино-вого тиоредоксина Е. coli, измеренные вблизи края поглощения селена
Электрический вектор Е синхротронного рентгеновского излучения параллелен оси в кристалле
Длина доты, А
ционные измерения выполнены при трех отобранных длинах волн синхротронной радиации. Одна длина волны соответствовала минимальной энергии аномального рассеяния (/^п), вторая максимальной энергии поглощения (7^'ах), а третья длина волны находилась вдали от
полосы электронного перехода атома Se и, следовательно, отвечала фактору нормального рассеяния (/°). На рис. 1.43 приведены зависимости факторов аномального рассеяния/'и/" от облучаемой длины волны, полученные при одной ориентации кристалла [Se-MetJ-тио-редоксина Е. coli. Высокая чувствительность /'и/" к изменению длины волны в области 0,98 А и четко выраженный краевой эффект указывают на большие возможности метода МАД в решении фазовой проблемы. Первоначально фазы находятся для нескольких аномально рассеивающих центров, а затем на этой основе — для всех неводородных атомов белка [562].
Таким образом, к началу 1990-х годов внутренние проблемы метода мультидлинноволновой аномальной дифракции были в основном решены. Он обрел форму, требуемую для его широкого применения в рентгеноструктурном анализе белков. Метод МАД имел прочный теоретический фундамент, был детально разработан в экспериментальном и препаративном отношении, оснащен всеми программами, необходимыми для обработки дифракционных данных, построения карт электронной плотности и расчета координат атомов пространственной структуры белковой молекулы. К этому времени его уровень в научно-методологическом плане, приборном обеспечении, степени математического формализма, разрешающей способности и надежности результатов оказался не ниже уровня метода мультиплетного изоморфного замещения тяжелыми атомами. Тем самым более очевидными выступили преимущества МАД, хотя по ряду причин, но главным образом в силу инерции, используемый десятилетиями метод МИЗ не скоро уступит свое место.
6. Проблема белка, т. 2
161
Быстрое признание нашел метод Хендриксона в синтезе селено-метиониновых производных белков. В работах последних лет кристаллы таких белков часто служат для получения дифракционных картин одновременно от аномального рассеяния, используя при этом резонансные длины волн, и от нормального рассеяния, рассматривая селен как тяжелый атом. Именно такой является работа В. Рамакришнана и соавт., в которой определена с разрешением 2,5 А трехмерная структура глобулярного домена линкерного гистона Н5 [512], [Se-MetJ-произ-водное домена синтезировано методами генной инженерии. Выращенные из него кристаллы полностью изоморфны кристаллам нативного белка. Для фазирования применены методы МАД и МИЗ. Авторы отметили, что обработка данных, выполненная традиционным способом в комбинации с недавно предложенной процедурой уточнения параметров тяжелых атомов, названной методом максимальной вероятности, или максимального подобия [563, 564], привела к более предпочтительным картам электронной плотности, чем способ Хендриксона и соавт., за которым закрепилось название алгебраического метода [558].
М. Ньюмен и соавт. [565] с разрешением 1,95 А установили кристаллическую структуру рестрикционной эндонуклеазы BamHl, состоящей из 213 аминокислотных остатков. Авторы обратились к использованию селенометионинового варианта после того, как безрезультатными оказались попытки интерпретировать карту Паттерсона, которая была построена по данным, измеренным для нескольких белковых производных тяжелых атомов. [Se-MetJ-эндонуклсаза экспрессирована в ауксотрофных клетках Е. coli, выращенных в среде, включающей наряду с 19 стандартными аминокислотами селенометионин вместо метионина [559]. Полученный таким образом объект исследования не отличался своей активностью от нативного фермента, а его кристаллы были полностью изоморфны кристаллическому состоянию последнего. Методологическая новизна этой работы заключается в том, что установление пространственной структуры эндонуклеазы осуществлено путем комбинации фазовой информации, заключенной в данных аномальной дифракции, полученной методом максимальной вероятности и алгебраическим методом [558, 563, 564]. И тот, и другой приводят приблизительно к одинаковым фазовым ошибкам по отношению к фазам уточненной модели. Авторы полагают, что усредненные фазы значительно ближе к истине, чем полученные одним из методов. Кристаллы [Se-Met]-BamHl при температуре 5° облучались тремя длинами волн, отвечающих краю (0,979 А) поглощения Se и удаленной области спектра (0,900 А).
Гонадотропин зародыша человека, структура которого была определена Хендриксоном и соавт., является гликопротеиновым гормоном плаценты (237 аминокислотных остатков), стимулирующим секрецию поддерживающего беременность стероидного гормона прогестерона [566]. Как рекомбинантный [Se-MetJ-белок, он был синтезирован в клетках яичника хомяка. Этот несколько неожиданный факт свидетельствует, что эукариотические клетки млекопитающих могут быть столь же высоко толерантны, как и прокариотические клетки Е. coli, к пол-
