Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
способность разных атомов существенно различается: у атомов водорода она в десятки раз меньше, чем у атомов углерода, азота, кислорода, в сотни раз меньше, чем у атомов фосфора, серы, хлора и в тысячи раз, чем у тяжелых атомов (платины, золота, ртути, урана). Поэтому в рентгеноструктурном анализе даже при высоком разрешении практически нельзя определить координаты атомов водорода, которые составляют около половины всех атомов белковой молекулы.
Нейтроны рассеиваются ядрами атомов, т.е. совершенно иным образом. Размеры ядер, причем ядер всех элементов, чрезвычайно
Таблица 1.12 Рассеяние нейтропов различпыми атомами
Атом ft • 10 см Атом ft 10 см
н -3,74 О 5,80
D 6,67 S 2,80
С 6,65 Gi 4,70
N 9,40
малы по сравнению с длиной волны нейтрона (используют потоки нейтронов с длиной волны, соизмеримой с длиной валентных связей), поэтому все атомы рассеивают нейтроны примерно одинаково. В табл. 1.12 приведены данные о рассеянии нейтронов, полученные для различных атомов [рассеивающая способность охарактеризована амплитудой рассеяния (Ь), которая в зависимости от спина ядра, если он не равен нулю, может иметь два значения ф+ и /г)].
Атомы водорода, не поддающиеся локализации при использовании метода рентгеноструктурного анализа, могут быть легко привнесены в найденную трехмерную структуру белка с помощью хорошо известных стереохимических правил. Такая процедура проводится автоматически на ЭВМ. Однако есть случаи, когда знание положений атомов водорода в молекулярной структуре имеет принципиальное значение и должно быть получено опытным путем. Как правило, это касается активных центров ферментов, где установление конкретных систем водородных связей очень важно, поскольку они играют определенную функциональную роль. В решении подобного вопроса необходимо рентгеноструктурный анализ дополнить изучением дифракции нейтронов. Возможность наблюдать положения водородных атомов значительно расширяет круг решаемых кристаллографией задач. Доступными для изучения становятся некоторые динамические аспекты пространственной организации белков, в частности конформационные флуктуации белковых молекул. В этом отношении одной из перспективных областей применения нейтронной техники является получение качественной информации о процессе замещения водорода на дейтерий, атомы которого по-другому проявляют себя в рассеивании нейтронов.
165
В 1950-е годы А. Гвидт и К. Линдерстрем-Ланг впервые использовали метод H/D-замены для изучения конформационной динамики белковых молекул [568]. Он основывался на определении скоростей изотопного обмена протонов амидных групп в нативных белках. Различие в скоростях, достигавшее 8—10 порядков, коррелировалось с доступностью обменивающегося протона, т.е. с положением амидной группы в трехмерной структуре белка. То, что обмен водорода на дейтерий совершался (хотя и медленно) даже у амидных групп, находящихся в центре глобулы и не имеющих непосредственных контактов с окружающей средой, было объяснено конформационной лабильностью белковой молекулы, ее ’’дыханием”.
В последние годы интерес к изучению динамических свойств белков заметно возрос, и нейтронная дифракция может оказаться чрезвычайно ценным методом для получения строго количественной структурной информации. Используемые ранее методы были не в состоянии устанавливать непосредственную связь между скоростью замещения H/D и положением соответствующих групп в белковой глобуле. Тем самым выводы о механизме конформационных флуктуаций неизбежно носили феноменологический характер, что ограничивало понимание причин, вызывающих это явление. Первый, кто обратил внимание на большие возможности нейтронной дифрации в H/D-анализе, был Б. Шенборн (1971 г.) [569—571]. В настоящее время с помощью такой техники исследованы процессы замещения амидных водородов в миоглобине, рибонуклеазе, трипсине и крамбине. Это были самые первые работы такого плана. Но они позволили установить новые факты, причем при анализе объектов, которые ранее уже были тщательно изучены другими методами. Например, при исследовании изотопного замещения ри-бонуклеазы А было обнаружено различное отнесение мест замещения, даваемое нейтронным анализом, химическими методами и использованием тритиевой замены. Установлено, что количественные результаты химического анализа, полученные для рибонуклеазы S, лишенной первых 20 остатков (пептида S), не могут быть перенесены на целый белок — рибонуклеазу А. Особенно интересны данные нейтронной дифрации по H/D-замене в трипсине, полученные А. Козиаковым [572, 573]. Они противоречат общепринятой трактовке обмена изотопов путем глобального кооперативного развертывания пептидной цепи.
Не менее плодотворна нейтронная дифракция в изучении частично и полностью связанных молекул воды в пограничном слое и внутри белковой глобулы. Детальный анализ структуры водного окружения белка с помощью нейтронов впервые провели Б. Шенборн и Дж. Хенсон [574]. Они обнаружили значительное расхождение в наборах из 40 прочно связанных молекул воды с исследованным ими СО-мио-глобином и исследованным Т. Такано метмиоглобином методом рентгеноструктурного анализа [575]. Надежная фиксация положений атомов водорода при нейтронной дифракции делает этот метод уникальным в изучении внутренних вращений вокруг одинарных связей, особенно вращений метальных групп. Из карт нейтронной плотности трипсина следует, что, несмотря на плотную упаковку белковой макромолекулы,
