Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
И. Шлихтинг и соавт. в качестве объекта исследования выбрали мутантный миоглобин, образующий гексагональную кристаллическую
153
HtS'52
L ,H Arg.48
-—
/ NH, 02-
Asp-235
Исходный
фермент
Asp-г 35
Предполагаемый комплекс Михаэлиса
Asp-235
yi-—ОН-’ ¦ Trp—19l| Asp-235
Соединение I (радикальный катион на Trp-191)
Реакция с цитохромом с (2е~+ 2Н+)
Тгр-1в1
Соединение I (нейтральный радикал на Тгр-191)
Рис. 1.41. Схема образования соединения I при взаимодействии цитохром-с-пероксидазы с перекисью водорода [498]
Рис. 1.42. Схема экспериментальной установки для получения рентгеновской дифракции кристаллами миоглобин с окисью углерода в процессе фотолиза [540—542]
решетку [540]. Образец охлаждался жидким гелием до ~ 20 К и облучался для получения дифракционной картины синхротронной радиацией, а для инициации и поддержания фотолиза видимым светом от обычного источника (рис. 1.42). По аналогичной схеме строился эксперимент в работе Т. Тенга и соавт. [541]. Различия заключались в использовании нативного миоглобина (из спермы кита), кристаллы которого имеют не гексагональную решетку, а моноклинную; образец охлаждался до температуры ~ 40 К и облучался мощным лазерным источником света. Результаты обоих исследований, за исключением некоторых количественных расхождений в оценке конформационных изменений активного центра миоглобина, совпали. Было найдено, что при фотодиссоциации комплекса молекула СО удаляется от атома Fe, но остается в активном центре и располагается параллельно плоскости группы гема на расстоянии ~ 3,6 А. Атом Fe одновременно смещается в ту же сторону на расстояние 0,2 А [540]. Помимо этого Шлихтинг и соавторы отметили изменения при фотолизе положений боковых цепей дистальных His, Arg и проксимального His, а также а-спирали F. Т. Тенг и соавторы таких наблюдений не сделали, что, по-видимому, нельзя объяснить разной упаковкой кристаллов нативного и мутантного миоглобина. Г. Филлипс ранее показал, что мутация образца, использованного в работе [540], не вызывает конформационных изменений в трехмерной структуре белка и не влияет на его физиологические свойства [543]. Отмеченные структурные изменения при фотолизе согласуются со спектральными данными и результатами расчета молекулярной динамики [544—547].
В этом разделе были рассмотрены результаты опубликованных
155
к концу 1994 г. рентгеноструктурных исследований механизма функционирования белков, выполненных с привлечением синхротронного излучения. Таких работ пока немного, но именно они отражают принципиальную тенденцию развития метода. Если несколько лет назад его задача могла формулироваться только как изучение трехмерных структур белковых молекул и их стабильных комплексов, то теперь доступными для исследования на том же атомном уровне становятся трехмерные структуры промежуточных соединений. Таким образом, рентгеноструктурный анализ перешел, ничего при этом не теряя в разрешающей способности и достоверности получаемых результатов, от изучения молекулярной морфологии начальных и конечных продуктов физиологических реакций к молекулярной морфологии промежуточных соединений. Это событие знаменует собой скачок в развитии метода, качественное изменение его возможностей в решении огромного числа новых задач молекулярной биологии.
4.2. МУЛЬТИДЛИННОВОЛНОВАЯ АНОМАЛЬНАЯ ДИФРАКЦИЯ
Самой сложной проблемой рентгеновской кристаллографии белка является фазовая проблема. Именно она около двух десятилетий, когда уже имелась полная ясность в отношении всех других принципиальных вопросов рентгеноструктурного анализа, сдерживала расшифровку дифрагированных белковыми кристаллами пучков лучей, построение карт электронной плотности и установление трехмерных молекулярных структур. Реконструирование пространственного строения белка по наблюдаемым в дифракционной картине многим тысячам рефлексов возможно лишь при знании амплитуды и фазы каждого из них. И если значение амплитуды можно оценить путем прямого измерения интенсивности вторичного рентгеновского излучения, то фаза есть расчетный параметр, нахождение которого непременно связано с привлечением дополнительного экспериментального материала.
Решение фазовой проблемы было найдено введением в рентгеноструктурный анализ белка его изоморфных производных невалентных комплексов белка с тяжелыми атомами (Au, Pb, Hg, Ag, Т1 и др.), присоединение которых не должно искажать пространственного строения белковой молекулы и кристаллической решетки. Тяжелые атомы обладают большой электронной плотностью и, следовательно, значительной интенсивностью томсоновского упругого рассеяния, что сказывается на структурных факторах многих рефлексов и заметно изменяет картину рентгеновской дифракции. Различие интенсивностей дифрагированных пучков кристаллами нативного белка и его производных можно использовать для определения фаз, если предварительно установить положения тяжелых атомов. Существует несколько различных способов решения этой задачи [198, 548].
Метод определения фаз с помощью тяжелых атомов, получивший название мультиплетного изоморфного замещения (МИЗ), впервые был
