Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
Ф°-
Таким образом, фазовая проблема может быть решена и без привлечения метода мультиплетного изоморфного замещения. Однако цена такого решения долгое время оставалась слишком обременительной для того, чтобы новый подход нашел широкое применение. Хотя он и достигал той же, что и метод МИЗ, цели, причем делал это
158
при использовании не нескольких, а лишь одного белкового кристалла, тем не менее требовал соблюдения по крайней мере двух трудновыполнимых условий. Во-первых, исследуемый образец должен содержать аномально рассеивающие атомы, которых в нативном белке может не оказаться. Во-вторых, для оптимизации эффекта аномального рассеяния необходим непрерывно настраиваемый на разные длины волн с высокой точностью и в широком спектральном диапазоне источник рентгеновского излучения. Первое условие не ведет к дополнительным осложнениям лишь в случае металлопротеинов, а второе требует полихроматической радиации и, следовательно, практически исключает применения рентгеновских трубок. В настоящее время отмеченные трудности метода мультидлинноволновой аномальной дифракции (МАД) в основном преодолены, что будет ясно из последующего изложения, и решающую роль начинают играть его очевидные преимущества перед традиционным подходом к решению фазовой проблемы (МИЗ). Число публикаций, посвященных рентгеноструктурному анализу белков с использованием МАД, растет и в ближайшем будущем этот процесс, по-видимому, приобретет лавинообразный характер.
В первый раз монополия в рентгеновской кристаллографии белков изоморфного замещения была нарушена в 1981 г., когда У. Хендриксону и М. Титеру удалось установить атомную трехмерную структуру крамбина по дифракционной картине одного кристаллического образца [553]. Проблема фаз была решена методом МАД при использовании трех длин волн синхротронного излучения и аномального рассеяния атомов серы остатков метионина, входящих в аминокислотную последовательность белка. Стало очевидно, что синхротронная радиация может сделать МАД мощным инструментом исследования структуры белков. Не в полной мере, однако, удовлетворяло использование серы в качестве аномально рассеивающего центра. Дисперсионный и абсорбционный компоненты фактора аномального рассеяния серы значительно уступают величине нормального компонента структурного фактора и во много раз меньше соответствующих величин компонентов аномального рассеяния более тяжелых атомов. Поэтому в последующем рентгеноструктурном анализе белков с помощью МАД от использования серы как аномально рассеивающего центра пришлось отказаться. Объектами исследования стали белки, содержащие в нативном состоянии атомы металлов (Fe, Zn, Си и др.), и изоморфные тяжелоатомные производные белков, как в методе МИЗ. Вслед за крамбином, используя аномальное рассеяние, были расшифрованы структуры парвальбумина [554], гемоглобина [555, 556], ферроксина и селенобиотинилстрептавидина [556], а также селенолантионина [557].
Приобретенный опыт работы с МАД позволил Хендриксону и соавт. усовершенствовать многие экспериментальные и математические процедуры резонансного метода [558]. Были разработаны специальные подходы к оптимизации величины сигнала, уменьшению систематических ошибок, нахождению факторов аномального рассеяния и оценке способом наименьших квадратов получаемых данных.
159
В результате фазы стали рассчитываться с помощью МАД столь же точно, как и при мультиплетном изоморфном замещении. Решение на основе эффекта аномального рассеяния проблемы фаз приобрело универсальную методологическую форму, приложимую к любым кристаллическим белковым образцам, содержащим аномально рассеивающие центры. Общий характер имеет также предложенный Хендриксоном и сотр. способ введения в белки необходимых при использовании МАД дифракционных решеток [559].
Точность результатов рентгеноструктурного анализа с МАД, как и МИЗ, очевидно, будет тем выше, чем совершеннее изоморфизм у производных белка с резонансными центрами в первом случае и тяжелыми атомами во втором. Ситуация в этом отношении более предпочтительна при аномальном рассеянии, поскольку здесь все необходимые для установления трехмерной структуры белковой молекулы данные можно получить при облучении несколькими длинами волн одного кристалла. Для реализации такого преимущества был необходим метод, который гарантировал бы сведение к минимуму вероятности нарушения изоморфизма при использовании in situ резонансных меток, был бы достаточно прост и мог бы применяться в рентгеноструктурном анализе любых белков. Весьма близок к удовлетворению этих требований метод приготовления селенометиониновых белковых препаратов, дающих аномальное рассеяние, который разработали Хендриксон и соавт. [559].
В 1957 г. Д. Кови и Г. Коэн обнаружили, что ауксотрофные клетки Е. coli, утратившие способность синтезировать метионин, могут успешно развиваться и давать не менее ста генераций при добавлении в питательную среду селенометионина [560]. Тем самым было показано, что необходимые для поддержания жизни Е. coli белки, в которых все остатки Met заменены на Se-Met, продолжают функционировать нормально. Позже эти результаты были подтверждены Д.Ле Мастером, который целенаправленно создал ауксотрофный для метионина клон путем повреждения Met А гена [561]. Появилась возможность производить синтез аминокислотных последовательностей Е. coli, в которых на всех местах, где положено быть остаткам Met, находятся остатки Se-Met. Развивая это направление, Хендриксон и соавт. [559] разработали метод встраивания остатков Se-Met в рекомбинантные белки, продуцированные плазмидами Е. coli. Предшествующие исследования авторов пространственного строения молекул селенолантиони-на [557] и селенобиотинилстрептавидина [556] с применением МАД-фазирования показали, что атом Se является эффективным центром аномального рассеяния. Поэтому можно сказать, что предложенный метод встраивания остатков селенометионина в положения метионина станет универсальным подходом для белков, особенно тех, которые не содержат в своем нативном состоянии естественных резонаторов.
