Физиологически активные полимеры - Платэ Н.А.
Скачать (прямая ссылка):
Учитывая различия в конформации окси- и дезоксиформ Нв и соответственно разную реакционную способность амино-гРУпп, связывание Нв с полимерами проводили в каждой из
указанных двух форм. Нв, фиксированный на полимере в дез-окси-форме, показал меньшее сродство к 02, которое было ближе к сродству исходного Нв. Это, по-видимому, объясняется •более «свободной» конформацией дезокси-формы.
Канадские авторы синтезировали конъюгаты Нв с диальде--гиддекстраном и с О-[ (2-бромацетамидоэтиламино) иминокарбо-нил] декстраном [22]. В последнем случае белок связывался с полимером за счет алкилирования доступных |393-SH-rpynn Нв. Конъюгат на основе диальдегиддекстрана (полученного из декстрана с М = 200—275 тыс.) циркулировал в кровяном русле животных заметно дольше, чем Нв, однако его газотранспортные свойства были существенно хуже из-за более высокого сродства к Ог. Конъюгаты Нв, полученные алкилированием производными декстранов с М от 20 до 200 тыс. [23], имели несколько лучшие кислородтранспортные свойства и невысокую вязкость из-за ограниченного числа сшивок молекул Нв полимером. Поскольку Нв можно рассматривать как полифункцио-нальный реагент по аминогруппам, а диальдегиддекстран — по альдегидным группам, то образование сшитых молекул становится неизбежным. В то же время молекула Нв содержит только две доступных SH-группы, а бромацетильное производное декстрана имело низкую степень замещения. Поэтому преобладало направленное одноточечное присоединение белка к полимеру с небольшим числом сшивок. В результате удалось получить с выходом >90 % конъюгат Нв с полимером с мольным соотношением белок : полимер 1:1 и низкой вязкостью (до 2,5 мм2/с). Этот конъюгат проявил свои кислородтранспортные свойства in vivo, поддерживая жизнь животных при снижении гемато-крита до ^2% [24]. Время полувыведения конъюгата из циркуляции составило 2,4 сут (1,9 сут с учетом аутоокислення в Ре3+-форму). Ингибирования эритропоэза не наблюдалось.
Те же авторы показали возможность применения гетероло-гичных Нв в виде декстрановых производных с тем же носителем на основе декстрана с М = 20 тыс. [25]. Повышения уровня иммунного ответа по сравнению с ответами на исходные Нв не наблюдалось. Сродство к 02 для Нв из разных источников увеличивалось при модификации в 2,2—3,4 раза, а коэффициент Хилла снижался с 2,7-—3,0 до 1,5—1,6.
Детальное исследование реакции диальдегиддекстрана с Нв показало, что М конъюгата растет по мере прохождения реакции (от 3 ч до 5 сут), причем уже через 6 ч свободный Нв практически исчезает из реакционной массы [26]. Одновременно увеличивается сродство конъюгата к 02: после 6-часовой реакции кислородно-диссоциационная кривая конъюгата очень близка к таковой для Нв, но через 32 ч или 5 сут сродство к Ог резко возрастает и форма кривой меняется. Это указывает на то, что многоточечное сшивание белка полимером приводит к резкому изменению свойств Нв, возможно, связанному с по-
вышенной стабилизацией окси-формы. Соответственно снижается и коэффициент Хилла (п — 2,70; 2,33 и 1,40 за 6 ч, 32 ч и 5 сут реакции). Таким образом, контролируемое связывание Нв. с диальдегиддекстраном, не приводящее к образованию высокомолекулярных сшитых конъюгатов, позволяет получать модифицированные Нв с кислородтранспортными свойствами, близкими к свойствам исходного Нв. Такие конъюгаты не токсичны в опытах in vivo.
Применение для модификации дезокси-Нв позволило получить конъюгаты с более низким сродством к Ог. Однако коэффициент Хилла в конъюгате был только 1,4—1,5, а склонность к аутоокислению очень велика: 50% мет-(Fe3+)-формы за 5 ч циркуляции. Время циркуляции в кровяном русле было невелико — период полувыведения составлял 2—2,5 ч по сравнению-с <1 ч для Нв. Сродство декстрановых конъюгатов Нв к гап-тоглобину оказалось пониженным в результате экранирования белковой части полисахаридом [27]. Английские исследователи заменили диальдегиддекстран на диальдегидное производное
2-гидроксиэтилкрахмала или продукт конденсации последнего с этилен-диамином и затем с глутаровым диальдегидом, но положительных результатов не добились [26]. Модификацией производного Нв с пиридоксальфосфатом N-гидроксисукцин-имидным эфиром О- (сукцинил) инулина синтезирован конъюгат,, способный переносить примерно в 5 раз больше Ог, чем свободный Нв [28]. Сродство конъюгата к 02 было ниже, чем у Нв (Р50 = 2,25 кПа против 1,86 кПа), но выше, чем у крови. При замене 72—75 % объема крови у крыс на раствор конъюгата (10 %-ное содержание Нв в кровяном русле) время циркуляции (полувыведения) составляло 21 ч против 3 ч для Нв. Авторы предложили использовать полученный ими конъюгат как заменитель крови.
Интересные возможности открывают звездообразные конъюгаты Нв с моноэфирами полиэтиленгликоля (10 молей на молекулу белка) [29], так как конъюгаты такой структуры имеют пониженную вязкость и не содержат сшивок. Число и длину боковых цепей в звездообразных конъюгатах можно регулировать, а определение точек локализации таких цепей не сопряжено с принципиальными препятствиями.
