Физиологически активные полимеры - Платэ Н.А.
Скачать (прямая ссылка):
Более перспективным, чем полимергемоглобиновые конъюгаты, для КЗПК представляются сшитые белки: Нв-альбумин-и особенно поли-Нв. Вязкость их растворов существенно меньше, чем растворов конъюгатов Нв с другими полимерами, благодаря компактной конформации белка. К тому же поли-Нв практически не содержит не переносящего кислорода балласта.
Авторы [25] сшивали Нв с альбумином и другими белками с помощью низших алифатических диальдегидов. Сродство полученных конъюгатов к кислороду было лишь немногим выше, чем у исходного Нв (на 0,65—0,91 кПа). Позже советские
авторы синтезировали конъюгат Нв с альбумином с помощью глутарового диальдегида [26]. Его Mw составляла 400 тыс., сродство к кислороду незначительно отличалось от такового для Нв, а аутоокисляемость не превышала практически приемлемых значений. В опытах in vivo конъюгат был способен поддерживать жизнь обескровленных животных. Дальнейшее снижение сродства конъюгата к кислороду было достигнуто ковалентным присоединением к нему пиридоксальфосфата: Ръо снизилось до 3,1—3,2 кПа (см. об этом ниже). Французские авторы конъюгировали окси- или дезокси-Нв с альбумином с помощью водорастворимого карбодиимида [27]. Сродство конъюгатов к кислороду было очень низким. Ни в одной из цитированных работ не было показано какой-либо специфической роли альбумина, конъюгированного с Нв.
Сшивание молекул Нв друг с другом с помощью бифункциональных реагентов представляется наиболее реальным путем получения внеэритроцитарного растворимого КЗПК- Внутримолекулярное сшивание фиксирует конформацию Нв и существенно ухудшает кислородтранспортные свойства. Поэтому попытка использовать внутримолекулярно сшитый Нв в качестве КЗПК успеха не имела [28], несмотря на то что выведение такого Нв через почки было замедленно, а стабильность к аутоокислению повышена. Межмолекулярное же сшивание Нв не должно, с одной стороны, фиксировать одну из конформаций Нв, а с другой, должно предупреждать диссоциацию Нв на димеры, сопровождающуюся снижением кооперативности обратимого присоединения кислорода.
Для межмолекулярного сшивания Нв описано множество бифункциональных реагентов. Реакция Нв с глутаровым диальдегидом была изучена еще в 1970 г., и было показано, что ее результаты зависят от концентрации реагентов [29]. Одновременно была отмечена неожиданно высокая стабильность связи глутарового диальдегида с белком. Позже это явление было объяснено тем, что в реакцию вступает не сам диальдегид, а продукты его кротоновой конденсации — олигомерные а,р-нена-сыщенные альдегиды (см. гл. 5). Начиная с 1975 г., появился ряд работ по получению поли-Нв, предназначенных для переноса кислорода в организме. Для сшивания Нв использовали бисиминоэфиры, диальдегиды, дивинилсульфон и ряд других бифункциональных реагентов [27, 30—36]. Американские исследователи показали, что различные бисимидаты сшивают Нв по «-аминогруппам лизина с образованием поли-Нв с М от 68 до 600 тыс. и более [30]. Число диссоциировавших или индивидуально сшитых субъединиц зависело от длины цепи бисимидо-эфира. Конъюгат циркулировал в кровяном русле животных значительно дольше исходного Нв, не вызывал образования антител к нему и довольно слабо связывался с гаптоглобином. Однако сродство к кислороду у поли-Нв было очень велико.
Таким образом, на первом этапе исследований по Нв удалось получить полимеризованный белок, более длительно циркулирующий в кровяном русле, чем исходный Нв, и сохраняющий способность транспортировать кислород. Однако, несмотря на отдельные удачные эксперименты на животных [37—39], для практического применения поли-Нв было необходимо довести его сродство к кислороду до сродства эритроцитов. В таком случае поли-Нв мог бы быть полноценным компонентом «искусственной крови». Осуществить это удалось с учетом двух экспериментально найденных факторов. Во-первых, сшивание Нв-должно происходить в нелигандированном состоянии, т. е. в менее компактной конформации. Во-вторых, молекула Нв должна содержать регулятор сродства к кислороду. Известно, что сродство Нв к кислороду в растворе (Р50=1,8—2,1 кПа) существенно превышает сродство Нв к кислороду внутри эритроцитов (для крови Р50 = 3,4 кПа в физиологических условиях, т. е„ при pH = 7,4, Рсо2 = 5,2 кПа и 37 °С). При гемолизе эритроцитов Нв быстро теряет ионно-связанный аллостерический регулятор сродства к кислороду — 2,3-дифосфоглицерат, в результате чего и происходит изменение сродства. Роль дифос-фоглицерата с успехом может выполнять пиридоксальфосфат, ковалентно связанный с концевыми аминогруппами р-цепей Нв. Введение остатков пиридоксальфосфата в Нв проводят па следующей схеме:
Стадия восстановления может быть исключена, так как альдимин достаточно устойчив. Процесс пиридоксилирования Нв не прост, особенно при проведении реакции в больших масштабах. Однако он был предложен для получения КЗПК [25].
Используя указанные принципы, удалось сшиванием пири-Доксилированного Нв глутаровым диальдегидом получить пи-ридоксилированный поли-Нв со сродством к кислороду, таким
