Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
1 мг белка [Reynolds, Tanford, 1970]. Огромный избыток полностью диссоциированных остатков сульфокислоты, привносимых с детергентом, в большинстве случаев делает несущественной роль собственного заряда белка. Постоянство соотношения детергент/белок делает практически одинаковым отношение отрицательного заряда к массе для любого белка, даже для гисто-нов с их заметным собственным положительным зарядом. Благодаря электрическому отталкиванию тесно расположенных по поверхности белка остатков серной кислоты поли-пептидная цепочка распрямляется и приобретает форму жесткого эллипсои-ца вращения. Его малая ось имеет длину 1,6 нм, а размер большой линейно связан с числом аминокислотных остатков, а следовательно, с молекулярной массой белка. Это справедливо лишь дляГнеразвётвленных полипептидов, лишенных дисульфидных мостиков, поэтому одновременно с обработкой ДДС-Na необходимо обеспечить полную денатурацию белка и разрыв всех S—S- , связей. С этой целью белковый препа-рат обрабатывают высокой концентрацией p-меркаптоэтанола при повышенной температуре.
Электрофоретическая подвижность (и') жесткого комплекса белок—ДДС-Na оказывается связанной с молекулярной массой белка (Л1) простым соотношением: и'=А—В lg М, где Ап В — коэффициенты, зависящие от пористости геля, температуры и других условий эксперимента. Величину и' удобнее представлять в относительных единицах, выражающих отношение путей миграции белка и бромфенолового синего за время электрофореза, т. е. в значениях введенной ранее величины Rf. Такая замена отразится только на значениях коэффициентов А и В. Нет смысла определять эти коэффициенты в каждом опыте. Одновременно с фракционированием исследуемой смеси можно провести электрофорез набора белков-«марке-ров», молекулярные массы которых точно известны. Разумеется, вся предварительная обработка ДДС-Na и меркаптоэтанолом должна быть строго одинаковой для исследуемого препарата и маркеров. При электрофорезе в пластине для смеси маркеров можно отвести отдельный трек. При использовании трубок маркеры лучше добавить прямо в препарат, так как нельзя гарантировать строгой идентичности условий электрофореза в двух разных трубках, д ¦
По окончании электрофореза, измерив пути миграции бромфенолового синего и каждого из маркеров, можно рассчитать значения R, и, зная молекулярные массы маркеров, построить
Ряс. 18. Линейная зависимость логарифма молекулярной массы (lg М) от относительного расстояния миграции белков (Rt) при электрофорезе в ПААГ
экспериментальную зависимость lg М от Rt для данного опыта. Если пористость геля выбрана удачно (см. ниже), такая зависимость получается линейной (рис. 18). Определив теперь Rt для интересующего нас белка, из графика можно найти для него ¦величину \gM и подсчитать М. Положение и наклон прямой на графике изменяются при вариачии концентрации ПААГ и других условий эксперимента, поэтому нельзя пользоваться ка-кой-либо стандартной калибровкой. График зависимости lg М от Rf надо строить для каждого опыта. Отметим также, что при определении R} надо вводить поправки на набухание или съеживание геля при фиксации, окраске белков и удалении красителя, приводя все к исходному линейному размеру.
Метод определения молекулярной массы белков электрофорезом в ПААГ с ДДС-Na завоевал себе прочную репутацию и используется очень широко. Тем не менее следует проявлять известную осторожность. Исследуемый белок может оказаться принадлежащим к той, по-видимому, сравнительно немногочисленной, категории белков, для которой количественное соотношение в комплексе с ДДС-Na существенно отличается от 1 : 1,4.
Есть данные о том, что на полноту комплексообразования с ДДС-Na может влиять распределение зарядов по полипептид-ной цепочке. Показано, например, что обработка рибонуклеазы малеиновой кислотой снижает количество связывающегося с ней ДДС-Na с 1,9 до 0,3 г на 1 г белка. Такая обработка не изменяет заметным образом молекулярной массы рибонуклеазы, но вносит отрицательный заряд карбоксила на место положительного заряда аминогруппы. С другой стороны, на связывании ДДС-Na с лизоцимом обработка малеиновой кислотой никак не сказывается [Tung, Knight, 1972]. Ненормальное связывание ДДС-Na может быть также обусловлено необычной обогащен-ностью белка какой-либо гидрофильной аминокислотой. Гликопротеиды хуже связываются с ДДС-Na, чем чистые белки.
Разной степенью связывания ДДС-Na, по-видимому, следует объяснить и успешное разделение а- и р-цепей глобина кролика электрофорезом в 12,5%-ном ПААГ с ДДС-Na. Различие молекулярных масс этих цепей (15419 и 16 000) вряд ли само по себе могло бы обеспечить это разделение (Wood, Shaeffer, 1975]. Недавно было показано, что единственная мутационная замена аминокислоты (Ар^->-Цис) в белке с молекулярной массой 26 ООО приводит к кажущемуся изменению этой величины на 1000. Существенно отметить, что такое изменение связано с заменой только одного из нескольких остатков аргинина, входящих в со,-став белка. Следовательно, в этом случае играет роль еще и окружение аргинина [Noel et al., 1979].
