Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Пулами препарата. Находившиеся далеко сзади молекулы белка догоняют (почти догоняют) ушедшие вперед молекулы. Весь исходный препарат, каков бы ни был его начальный объем, в самом верху рабочего геля стягивается в тонкую полоску белков. Отсюда и начинается их медленная миграция в мелкопористом геле при щелочном значении pH, т. е. фракционирование белковой смеси. Между тем граница раздела ионов хлора и глицина уходит все дальше вперед, и через какое-то время весь рабочий гель оказывается в Трис-глициновом буфере примерно с тем же pH. Замена буфера не сказывается на разрешающей способности рабочего геля, а то обстоятельство, что фракционирование белков начинается с узкой исходной зоны, дает колоссальный выигрыш — разрешающая способность системы в целом резко увеличивается. Для полноты картины отметим, что заряженные ионы Трис+, участвуя в поддержании pH буфера, будут, замещая друг друга, медленно мигрировать вверх, в сторону катода. Ввиду малой подвижности этих ионов их вклад в электропроводность невелик.
Аналогичную картину ступенчатого электрофореза легко представить себе и для кислого буфера рабочего геля. В качестве слабой («буферной») кислоты можно использовать уксусную, а роль быстро мигрирующего иона «поручить» К+. В качестве цвиттериона, поставляющего медленно мигрирующие ионы, берут р-аланин. Подбор количественного соответствия концентраций и pH дает следующую пропись для построения системы. Для получения буфера рабочего геля 4,3%-ный водный раствор уксусной кислоты титруют КОН до pH 4,3. Буфер формирующего геля готовят аналогичным титрованием 0,35%-ного раствора уксусной кислоты до pH 5,8. Буфер верхнего электрода (анода) получают из 0,\)35 М водного раствора ^-аланина, титруя его до pH 4,5 опять-таки уксусной кислотой. Напомним (и это следует не упускать из виду, особенно для лабильных белков), что pH буфера рабочего геля во время фракционирования в нем белков оказывается несколько иным, чем первоначальный (примерно на 0,5 выше в случае использования щелочного буфера и настолько же ниже — для кислого).
Мочевину, детергенты (ДДС-Na, Тритон X-100 и Твин-80), а также p-меркаптоэтанол или дитиотреитол можно вводить в состав буферов обоих гелей, например: с целью растворения труднорастворимых белков или для защиты их от окисления.
Как уже упоминалось, ступенчатый электрофорез можно использовать и для разделения белков, находящихся в комплексе с ДДС-Na. Такая система была разработана Лэммли еще десять лет назад [Laemmli, 1970]. С тех пор она приобрела чрезвычайную популярность. Хотя выше и было вйсказано некоторое сомнение в том, что ее использование всегда оправдано, система заслуживает подробного описания.
В качестве рабочего геля в ней используют 10%-ный ПААГ, формирующего — 3%-ный; для обоих гелей С=2,6. Буфером
рабочего геля, как и у Ористейна и Дэвиса, служит 0,375 М Трис-НС1 (pH 8,8) с добавлением ДДС-Na до 0,1%. Попутно отметим, что 0,1%-ный ДДС-Na не препятствует развитию бактериальной флоры при комнатной температуре, поэтому его надо хранить на холоду. Электрофорез ведут в трубках диаметром 6 мм и длиной 15 см. Рабочий гель полимеризуют на длину 10 см, формирующий — на 1 см. Для формирующего геля Лэм-мАи использовал буфер вдвое большей концентрации, чем Орн-стейн и Дэвис (0,125 М Трис-НС1, pH 6,8, с 0,1% ДДС-Na). Для полимеризации в. оба геля он вносил по 0,025% персульфата аммония и ТЕМЕД. Верхний электродный буфер Лэммли содержал Трис впятеро более высокой концентрации, чем цитировалось выше (0,025 М), титрованный глицином до той же ве-> личины pH (8,3), чему соответствовала и впятеро более высокая концентрация глицина (0,192 М). 0,1% ДДС-Na присутствовал и в этом буфере.
Белковый препарат (0,2—0,3 мл) вносят в 0,0625 М Трис-НС1 (pH 6,8), содержащем 10% глицерина и 0,001% бромфено-лового синего. В препарат добавляют ДДС-Na до 2% и р-мер-кацтоэтанол до 5%, а затем прогревают его в течение 1,5 мин на кипящей водяной бане. Цель такой обработки была указана выше. Если исходный белковый препарат имеется в виде осадка-, то его следует сначала растворить в буфере, а потом уже добавлять ДДС-Na из концентрированного раствора. В противном случае на поверхности осадка комплекс белок—ДДС-Na может образовать корку, препятствующую его полному растворению [Maizel, 1971].
Электрофорез при силе тока 3 мА на трубку занимает 7 ч. Фиксацию белков в 50%-ном растворе ТХУ ведут в течение ночи, окрашивание свежеприготовленным 0,1%-ным раствором СВВ R-250 в 50%-ной ТХУ — в течение часа ттри 37°. Избыток красителя из геля вымывают диффузией в 7%-ной уксусной кислоте.
Система ЛэммЛи так же успешно используется для электрофореза в пластинах ПААГ. Для иллюстрации на рис. 22 показано расположение полос при сопоставлении субъединичного состава трех РНК-полимераз амебы [D'Alessio et al., 1979]. Хорошо видна высокая степень разрешения близких по молекулярной массе полипептидов. Иногда ступенчатый электрофорез по Лэммли используют в сочетании с градиентом пористости рабочего геля, что еще более повышает разрешающую способности метода (Mahadik et al., 1976]. В случае угрозы агрегации, например при фракционировании кислых белков хроматина, б оба геля системы Лэммли можно ввести мочевину [Wilson, Spel-sberg, 1975].
