Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование" -> 26

Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование — М.: Наука, 1981. — 288 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforeziultracentrifiguriya1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 20 21 22 23 24 25 < 26 > 27 28 29 30 31 32 .. 130 >> Следующая

Рассмотренные примеры не могут дискредитировать плодотворный метод определения молекулярной массы белков электрофорезом с участием ДДС-Na. Они лишь указывают на необходимость некоторой осторожности и критичности в оценке результатов эксперимента, особенно с малоизученными белками.
Выбор пористости геля
При данной пористости (концентрации) геля описанная выше линейная зависимость имеет место только для белков, молекулярные массы которых лежат в определенном интервале. Слишком крупные для данного геля белки, очевидно, вовсе не смогут мигрировать в нем. Подвижности слишком малых белков, для которых поры геля практически не создают препятствий, будут зависеть не от их молекулярной массы, а только от отношения заряда к массе. Как указывалось, в присутствии ДДС-Na это отношение одинаково для большинства белков. Для ориентировки можно назвать некоторые цифры. Так, для одинаково сшитых гелей (С=3,3) были рекомендованы следующие значения Т в зависимости от молекулярной массы белков (М) [Dunker, Rueckert, 1969]:
Т, % 5 10 15
М, тыс. дальтон 18—330 10—100 10—60
Фирма BDH для своего стандартного набора белков-маркеров в интервале М 56—280 тыс. дальтон предлагает использовать гели с Т=3,3, а в интервале 14—72 тыс.— с 7=10; в обоих случаях С=2,6. Отметим попутно, что эффект торможения миграции биополимеров в слабосшитых гелях с С<2,6 быстро ослабляется с уменьшением С при неизменном значении Т. По-видимому, в этом случае ярко проявляется способность жесткого комплекса белок—ДДС-Na раздвигать гибкие, слабосшитые нити акриламида.
Для определения молекулярных масс пептидов та же фирма выпускает набор стандартных фрагментов миоглобина с диапазоном М 2,5—17 тыс. Для него и соответствующих пептидов рекомендуется использовать сильно сшитый гель (7’= 12,5; С= = 9), содержащий 8 М мочевину, которая усиливает торможение малых пептидов в геле.
О важности правильного выбора пористости геля можно судить из сопоставления двух картин разделения набора из семи маркерных белков (рис. 19) [Fehrnstrom, Moberg, 1977]:
Белок М, дальтон lgM Белок М, дальтон М
Цитохром с 11700 4,068 Овальбумин 43000 4,634
Миоглобин 17200 4,236 7-Глобулин (Н-цепь) 50 000 4,699
у-Глобулин (L-цепь) 23500 4,371 Человеческий альбумин 68000 4,832
Карбоангидраза 29 000 4,462 Трансферрин 77000 4,886
Разделение вели в приборе «Мультифор», использовав 5%- и 10%-ный ПААГ. Легко видеть, что в 5%-ном геле миоглобин движется почти с такой же скоростью, как и цитохром с. При перенесении результатов этих опытов на графики (рис. 20) получается, как и следовало ожидать, что точка, отвечающая по-
Рис. 19. Влияние Пористости геля на характер миграции различных белков-маркеров [Fehrnstrom, Мо-berg, 1977]
1 — цитохром с; 2 — миоглобин;
3 — v-глобулин; 4 — карбоан-гидраза; 5 — овальбумин; 6 — человеческий альбумин; 7-тран-сферрин; 8 — смесь всех маркеров. Л — 5%-ный ПААГ; Б — 10%-ный ПААГ
Рис. 20. Графики зависимости IgAf от Rf, построенные по данным рис. 19
ложению цитохрома с в 5%-ном геле, выпадает из прямой линии, проходящей через все остальные точки, тогда как для 10%-ного геля она оказывается на такой прямой.
Присутствие мочевины и неионных детергентов
Хотя для коротких олигопептидов присутствие мочевины оказывается полезным, при электрофорезе белков ее не следует вводить в гель. Мочевина вносит конформациойные изменения в структуру белка. Влияние этих изменений как на степень связывания ДДС-Na, так и на характер миграции комплекса белок— ДДС-Na в геле еще не изучено.
Из аналбгйчных соображений следует удалять из белкойбго препарата перед его обработкой ДДС-Na другие детергенты, в частности неионные. Иногда это удается добиться за счет внесения в препарат еще большего избытка ДДС-Na, с тем чтобы он вытеснял неионный детергент из связи с белком, образуя с ним свободно растворенные смешанные мицеллы. Такие мицеллы могут «уходить» от комплекса белок—ДДС-Na, быстро мигрируя в электрическом поле [Nielsen, Reynolds, 1978]. Широко используемый для .растворения мембранных белков "Тритон Х-100 сильно мешает проведению .электрофореза, в. ПААГ с ДДС-Na. Его можно извлечь из белкового препарата экстрак-цйёи~хлороформом. Чтобы предотвратить выпадение плохо растворимых белков в осадок, перед экстракцией к препарату следует добавить ДДС-Na до 1%, который в хлороформ не переходит [Horikawa, Ogawara, 1979].
Выбор рабочего буфера геля
Из изложенного ясно, что pH буфера в этом варианте электрофореза не играет существенной роли, так как заряд белка определяется его комплексированием с ДДС-Na. Обычно работают с нейтральными буферами. По традиции, идущей еще от пионерской работы Вебера и Осборн [Weber, Osborn, 1969], часто используют 0,1 М Na-фосфэтный буфер, pH 7,1. Его концентрация обусловлена только желанием обеспечить 10-кратное различие в электропроводностях буферов геля и препарата. В качестве последнего берут 0,01 М Ыа-фосфат, pH 7,1. Как уже указывалось, такое различие обеспечивает концентрирование исходной полосы при переходе белков из буфера препарата в гель. Однакб ввиду большой электропроводности Na-фосфэтного буфера напряженность поля приходится ограничивать значением 5 В/см, что замедляет процесс разделения, поэтому вместе Na-фосфат-ного имеет смысл использовать другой, менее проводящий буфер, например имидазолфосфатный, pH 7. Молярность рабочего буфера можно снизить до 0,05 М, сохранив для буфера препарата концентрацию 0,01 М. Это позволит значительно увеличить напряженность поля и сократить продолжительность электрофореза.
Предыдущая << 1 .. 20 21 22 23 24 25 < 26 > 27 28 29 30 31 32 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed