Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование" -> 24

Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование — М.: Наука, 1981. — 288 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforeziultracentrifiguriya1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 18 19 20 21 22 23 < 24 > 25 26 27 28 29 30 .. 130 >> Следующая

Фракционирование гистонов и других щелочных белков.
5%-ный (0,9 М) раствор уксусной кислоты с добавлением 4—
8 М мочевины часто используют для электрофоретического фракционирования гистонов [Panyim, Chalkley,- 1969]. Молекулярные массы гистонов лежат в диапазоне 11—22 тыс. дальтон, поэтому для их разделения используют мелкопористые гели (Т= 15^-20). Положительно заряженные в кислой среде гисто-ны мигрируют в направлении катода. Наибольшей подвижностью обладает гистон Н4, затем следуют Н2А, Н2В и НЗ, которые в этой простой системе разделяются довольно плохо. От них заметно отстает относительно более крупный гистон Н1. В качестве лидирующего красителя используют пиронин.
Недавно Спайкер описал систему фракционирования гистонов в двуступенчатом ПААГ с «кислой мочевиной». Основной рабочий гель — пластина (толщиной 0,5 мм) 15%-го ПААГ в 0,9 М СНзСООН с 2,5 М мочевины. Над ним полимеризована полоска формирующего геля: 7,5% ПААГ в 0,375 М CHsCOOK, pH 4, с 2,5 М мочевины. Электрофорез при повышенном напряжении — за 1—2 ч. Качество полос и их разрешение в такой системе сильно выигрывают [Spiker, 1980].
Электрофорез «в кислой мочевине» успешно используют и для фракционирования других щелочных белков: рибосомных, факторов инициации трансляции, субъединиц РНК-полимеразы и др. Впрочем, намного более совершенное разделение сложных смесей этих белков происходит при двумерном электрофорезе, когда фракционирование «в кислой мочевине» используют в одном из направлений. Ниже, при анализе метода двумерного электрофореза, будут даны соответствующие ссылки.
Если есть опасение, что воздействие уксусной кислоты на белок может оказаться слишком жестким, то ее 50%-ный раствор титруют КОН до pH 4,3—4,5. При этом надо иметь в виду, что электропроводность такого буфера будет за счет ионов калия значительно выше, чем одной уксусной кислоты, что потребует соответствующего уменьшения напряжения, подаваемого на гель.
Описано электрофоретическое разделение гистонов и при pH 7,8 (0,18 М глицилглицин, титрованный NaOH), которое используется для изучения гистон-гистонового взаимодействия и некоторых лабильных модификаций гистонов. Все гистоны, кроме Н1, при этом почти одинаково и относительно слабо заряжены, поэтому фракционирование идет главным образом по молекулярной массе. Добавление мочевины предупреждает агрегацию гистонов, однако несколько изменяет взаимное расположение полос. Мочевина разворачивает гистоны Н2А, Н2В и НЗ, но не влияет на конфигурацию Н1 и Н4. По-видимому, эти по-
следние развернуты и в отсутствие мочевины [Hoffman, Chalk-ley, 1976].
Щелочные белки рибосом удается разделять не только в кислых, но и в слегка щелочных условиях, например в Трис-борат-ном буфере, pH 8,7. Электрофорез проводят в 4%-ном ПААГ [Howard, Traut, 1973]. Исходный белковый препарат полимери-зуют в геле с мочевиной на середине высоты трубки. Вблизи изО-электрической точки часть рибосомальных белков оказывается заряженной отрицательно, а. другая — положительно. Миграция в электрическом поле идет в обе стороны, к катоду и аноду. Щелочные белки рибосом при pH 8,7 растворяются с трудом и только в присутствии 6 М мочевины, которую вводят также и в бу фер геля.
Электрофорез хроматина. Электрофоретическое фракционирование хроматина после его обработки микрококковой нуклеа-зой ведут-в буфере низкой ионной силы, например в 0,01 М три-этиламмоний-НС1 (pH 7,6; 2 мМ ЭД'ГА), что обусловлено плохой растворимостью хроматина в более концентрированных буферах. Хроматин в целом (благодаря ДНК) заряжен отрицательно и мигрирует к аноду. Удается разделить субнуклеосомы, моно-нуклеосомы с различным содержанием ДНК и белков, лежащих вне их «ядра» («соге»), а также ди- и тринуклеосомы. Ввиду малой электропроводности разбавленного буфера при напряженности 15 В/см сила тока через трубку диаметром 6 мм составляет всего лишь 3 мА. Электрофорез в трубках длиной 7 см занимает 1,5 ч.
РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ ПО РАЗМЕРУ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДДС-Na
Существо метода
Рассмотренный выше электрофорез белков в простой системе удобно использовать для их разделения, но не для характеристики. Электрофоретическая подвижность каждого белка в простой системе зависит одновременно и от его суммарного заряда, и от молекулярной массы, и от конфигурации, и, наконец, от жесткости упаковки полипептидной цепи. Вклад каждого из этих факторов неизвестен и может существенно изменяться в зависимости от условий электрофореза. Для установления строгой количественной корреляции между каким-либо одним из перечисленных параметров и электрофоретической подвижностью белка надо исключить влияние всех остальных.
Электрофорез в ПААГ с использованием ДДС-iNa позволяет фракционировать белки в зависимости от значений, только одного параметра — их., молекулярной массы. Для этого белки в исходном растворе препарата обрабатывают не менее чем трехкратным избытком ДДС-Na. За счет гидрофобных взаимодействий детергент примерно одинаково связывается с подавляющим большинством белков в соотношении 1,4 мг ДДС-Na на
Предыдущая << 1 .. 18 19 20 21 22 23 < 24 > 25 26 27 28 29 30 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed