Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Иногда следует проверить сохранность ферментативной активности белка в ходе электрофореза в связи с возможностью разобщения фермента с другими белками или необходимыми для его работы кофакторами. Такую проверку можно проводить следующим образом: на разных стадиях электрофореза вырезать и гомогенизировать участки геля, содержащие соответствующую белковую полосу, и прямо в гомогенате, в сопоставимых условиях, проверять сохранение активности фермента, используя возможность диффузии субстрата реакции в гель, а ее продукта — из геля.
Загрузка геля и подготовка препарата
Исходный белковый препарат растворяют в том же рабочем буфере, но меньшей концентрации (в 5—10 раз). По рассмотренным выше причинам это приводит к значительному сужению исходной зоны белков при ее вступлении в гель. Если электрофорез идет в присутствии мочевины, то ее концентрация в разбавленном буфере должна быть такой же, как в рабочем буфере геля. Еще раз подчеркнем необходимость удаления солей из препарата; в противном случае эффект концентрирования белка при вступлении в гель будет смазан. Недавно был предложен простой и остроумный способ диализа белкового раствора в капле на плавающем мембранном фильтре [Marusyk, Sergeant, 1980].
Иногда проводят предварительное полное восстановление белка путем прединкубадии его в течение ночи при комнатной температуре в буфере с pH 8,5—9, содержащем 0,1 М р-мерка.п-тоэтанола и 9 М мочевины (щелочное значение pH буфера способствует восстановительному эффекту р-меркаптоэтанола).
В раствор препарата добавляют до 10% глицерина или сахарозы, чтобы облегчить его подслаивание под электродный буфер (см. выше). Наконец, в препарат вносят еще и краситель, например бромфеноловый синий до концентрации 0,01%. Миграция этой «лидирующей» зоны до конца геля определяет момент окончания электрофореза. Заметим кстати, что при последующей фиксации белков бромфеноловый синий обесцвечивается. Если далее предполагается определение величины Rfi то положение окрашенной полоски сразу после извлечения геля из форму следует отметить (например, вколоть в гель тонкую проволочку).
Как уже подчеркивалось, препарат должен быть заведомо свободен от пыли, нерастворенных белков и других частиц. После внесения препарата в трубку или карман пластины на 5— 15 мин включают напряжение, пониженное примерно вдвое против расчетного. За это время лидирующий краситель должен полностью войти в гель. Такая процедура улучшает условия формирования исходной белковой полосы в геле. Затем переходят на расчетный режим электрофореза по напряжению и силе тока.
Вопросы фиксации, окраски и других методов обработки белков после электрореза, как и способы определения радиоактивности и элюции белков, рассмотрены отдельно ниже.
Некоторые примеры
Теперь для иллюстрации целесообразно привести некоторые примеры, отнюдь не отражающие всего безграничного разнообразия приложений электрофореза белков, даже в его простейшем, только что рассмотренном варианте.
Обзорный клинический анализ белков сыворотки человека. В приборе с горизонтальным гелем (типа «Мультифор») одновременно можно обследоват! сыворотку кровн 20 пациентов. Условия разделения: гель указанных выше размеров, Г—3,5, С== 2,6; 0,1 М Трис-глициновый буфер, pH 8,9; напряженность поля 15 В/см, сила тока 45 мА; температура охлаждающей воды 10°; преэлектрофорез в течение 30 мин при силе тока 60 мА. Препараты сыворотки разбавляют в отношении 1 :3 тем же буфером, разведенным в 10 раз. Объем каждого препарата б мкл. В первые 10 мин электрофореза силу тока снижают до 20 мА. Скорость миграции бромфенолового синего 4,5 см/ч; общая продолжительность электрофореза 1,3 ч. На рис. 17, Л сопоставлены картины фракционирования белков сыворотки 10 пациентов с различными заболеваниями (йо два препарата от каждого). Крайние слева и справа пары треков содержат сыворотку нормальных доноров. Направление миграции белков — снизу вверх. Интенсивные пятна вверху — низкомолекулярные компоненты сыворотки.
Заметно лучше, особенно в области крупных белков, те же препараты разделяются в более концентрированном геле (Г=7,5; С—2,6), однако в этом случае часть наиболее крупных белков выпадает в осадок на границе геля
ш
/Л
f sr
« ..Як -
&.^ ;:i|i
ill!,
т т * к-
-¦»:- i-- >$*¦:
' • ** • ^ ;
т*«т^т*шт*штт,*тг „,, ^ Ж» -iisi _ «*• «*» Л1 -#г
^ A, 'iiv
** 1% -«gS ¦*.• <*,*
'¦'44
v*>v-;c
>¦
¦%&¦¦/. ¦
v
ite:i ¦:.:
»й
* * * ' *
аЦ Л'
Рис. 17. Фракционирование белков сыворотки пациентов с различного рода заболеваниями в горизонтальной пластине на приборе «Мультифор» [Fehrnstrdm, Moberg, 1977]
Л — 3,5%-ный ПААГ; Б — 7,5%-ный ПААГ; миграция белков — снизу вверх
(рис. 17, ?), Скорость миграции бромфеноловоГо синего 1,8 см/ч при рабочей силе тока 40 мА; продолжительность разделения 2,8 ч [Fehrnstrom, Moberg, 1977].
