Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Другой очень эффективный способ сужения полос — использование градиента пористого геля. В этом случае при миграции вдоль геля першний край каждой полосы все время оказывается в области ч*ь более концентрированного геля, чем задний. Молекулы- белка, расположенные ближе к переднему краю полосы, тормозятся трением о гель сильнее, чем идущие сзади, что и приводит’ к непрерывному сужению полос в ходе их продвижения по гелю. Силу этого эффекта убедительно продемонстрировали специалисты фирмы «Pharmacia» на выпускаемых этой фирмой стандартных пластинах с градиентом концентрации ПААГ (4—30%). Начав электрофоретическое фракционировав ние белков сыворотки, они затем прерывали его и оставляли' пластину на 60 ч при комнатной температуре. За это время дифт| фузий полностью размывала сформировавшиеся было белковые! полосы. Однако через 6 ч после возобновления электрофореза удавалось получить четкую картину полос, содержащую все обычно наблюдаемые компоненты сыворотки (рис. 16).
Введение мочевины и р-меркаптоэтанола. Некоторые артефакры
Высокая концентрация белков в зонах может привести к их осаждению или, по крайней мере, образованию агрегатов: димерных, тримерных и более крупных белковых комплексов, которые могут давать дополнительные полосы. Агрегация происходит, в основном, за счет водородных связей. Для ее предотвращения в рабочий буфер нередко добавляют мочевину в концентрации 4—8 М. Она должна быть хорошо очищена, в частности деионизована. Кроме того, следует всегда иметь в виду возможность частичного разложения мочевины с образованием циановой кислоты и карбамоилирования белков. Это особенно относится к долго хранящимся буферам, поэтому лучше добавлять сухую мочевину в буфер непосредственно перед приготовлением геля. Если все же возникает подозрение, что некая полоса появилась за счет карбамоилирования, то следует добавить в исходный препарат цианат и посмотреть, не усилится ли подозритель-I ная полоса. Для предварительной деионизации маточный рас-(твор мочевины (ЮМ) суспендируют с бифункциональной ионообменной смолой (например, А^ К01 у 8^ в соотношении 5 г смолы на 100 мл раствора в течение часа при комнатной температуре.
Р-Меркаптоэтанол в концентрации 1—5% нередко вносят в исходный белковый препарат для предохранения его от окисления и образования лишних дисульфидных мостиков. Более энергичное воздействие с разрывом нативных дисульфидных связей и разделением белковых субъединиц производят путем нагревания белкового раствора до 90—100° в присутствии не только 0-меркаптоэтанола или его аналогов, но и ДДС-Na.
В некоторых случаях при использовании боратного буфера или буферов, содержащих аминокислоты (глицин, аланин), возможно образование комплексов компонентов буфера с белками. Их электрофоретическая подвижность может оказаться несколько иной, чем у чистых белков, и соответствующие белковые полосы раздвоятся. Проверить такого рода Артефакт можно повторным электрофорезом. В силу равновесного характера процесса образования комплексов каждая из двух полос дублета при ее повторном электрофорезе в том же буфере даст снова две полосы.
В главе 1 уже упоминалось об опасности, которую представляют для белков сохраняющиеся в геле после полимеризации долгоживущие свободные радикалы. Указывалось также на способ их удаления — «преэлектрофорез», т. е. пропускание тока через гель без внесения препарата. Добавим, что в особых случаях для полной очистки от радикалов во'время преэлектрофо-реза через гель пропускают такие связывающие их соединения, как цистеин, меркаптоуксусная (тиогликолевая) кислота или гидрохинон.
При фракционировании очень малых количеств белка может
оказаться заметной сорбция их на геле (белки «размазывают-ся» по гелю). Блокировать это явление можно, вводя в исходный препарат дополнительный быстро мигрирующий белок. Проходя через гель впереди всех остальных белков препарата, он насыщает собой центры неспецифической сорбции в геле.
Лидирующие красители
Для наблюдения за ходом электрофореза в исходный препарат вносят краситель, мигрирующий в том же направлении, что и фракционируемые белки. Он не должен заметным образом связываться с белками, а скорость его продвижения по гелю должна быть заведомо больше, чем у наиболее быстро мигрирующего белка. Вместе с тем краситель не должен слишком сильно отрываться от белков, чтобы его прохождению до конца пластины или трубки соответствовало использование большей части находящегося в них геля для фракционирования белков. Быть может, по ассоциации с велосипедными гонками за лидером, этот краситель называют лидирующим («tracker dye»).
В щелочных и нейтральных буферах, когда кислые белки заряжены отрицательно и мигрируют к аноду, а также для любых белков в комплексе с ДДС-Na (см. ниже) используют отрицательно заряженные красители. Наибольшее распространение получил бромфеноловый синий, имеющий достаточно сложную структуру; в его состав, в частности, входят два дибромфеноль-ных остатка. Иногда используют еще более сложно построенный краситель — ксиленцианол, электрофоретическая подвижность которого примерно вдвое ниже, чем бромфенолового синего, поэтому его используют при фракционировании крупных белков и нуклеиновых кислот.
