Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование" -> 19

Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование — М.: Наука, 1981. — 288 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforeziultracentrifiguriya1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 13 14 15 16 17 18 < 19 > 20 21 22 23 24 25 .. 130 >> Следующая

В процессе электрофореза электрическое сопротивление геля может изменяться (чаще всего увеличивается). Причиной этого является замена более подвижных ионов буфера в геле на менее подвижные, например при ступенчатом электрофорезе
Рис. 15. Прибор для электрофореза в вертикальных пластинах с циркуляцией буфера (Тип GE-2/4 фирмы «Pharmacia»)
Как уже отмечалось, для сокращения продолжительности разделения и уменьшения диффузии зон электрофорез желательно вести при максимальном напряжении. Его начальное значение ограничивается требуемой вначале силой тока и максимально допустимой для данного прибора мощностью. По мере роста сопротивления в геле сила тока снижается, и напряжение можно увеличивать. Современные источники напряжения делают это автоматически, поддерживая заданный постоянный уровень мощности, рассеиваемой в геле. От опасного (с точки зрения надежности изоляции) повышения напряжения при этом можно застраховаться, ограничив максимально допустимую его величину. Достигнув ее, прибор переключается на режим поддержания постоянного напряжения, поэтому при дальнейшем возрастании сопротивления сила тока и расходуемая в геле мощность начинают снижаться.
В некоторых случаях сопротивление всей цепи электрофореза может и уменьшаться. В частности, это может происходить как из-за нагревания геля (напомним, что подвижность ионов с температурой возрастает), так и за счет накопления ионов в электродных резервуарах. В этих случаях источник тока, отрегулированный на постоянную мощность, автоматически снижает напряжение, а максимально допустимая сила тока может быть заранее ограничена. Такого типа источники («Constant power supply») выпускаются фирмами «Pharmacia» - (модель ECPS 3000/150) и LKB (модель 2103). В других типах источнй*
ков (EPS 500/400 фирмы «Pharmacia» и модель 500 фирмы «Bio-Rad») можно заранее установить постоянные значения напряжения или тока и задать величину максимально допустимой
мощности, по достижении которой соответственно напряжение или ток начинают автоматически уменьшаться.
Загрузка геля. Ширина белковых зон
Очевидно, что разделение близко идущих зон белков будет тем успешнее, чем уже сами эти зоны, поэтому при электрофорезе следует заботиться о максимальном сужении белковых зон (пОлос). Это накладывает ограничения на допустимую загрузку геля. Разумеется, строгость таких ограничений зависит от состава белковой смеси и характера разделения полос. В качестве ориентировочного максимума можно принять загрузку порядка
1 мг суммарного препарата белка на 1 см2 сечения геля. Для кармана шириной 5 мм в пластине толщиной 1,5 мм это соответствует примерно^75мк?> белка, а для трубки диаметром 6 мм — до 200 мкг. Идентификацию полос белка по их окраске можно проводить при загрузках, в 10 раз меньших. При перегрузке белковые полосы бывают резкими в передней своей части и размытыми сзади. При этом следует всегда считаться с возможностью преципитации белка в Момент вступления его в гель, когда все макромолекулы стягиваются в узкую полоску и локальная концентрация их сильно увеличивается.
Чем меньше загрузка геля, тем лучше разделение близких зон. Ограничения в этом случае накладываются только методами обнаружения слабых полос. Поскольку диффузия зон идет во времени, всегда желательно сокращение продолжительности электрофореза, но не за счет чрезмерно высокой силы тока, вызывающей неравномерный нагрев геля и искажение полос. Электрофорез при пониженной температуре в этом плане дает немного. Интенсивность диффузии уменьшается, но вместе с тем снижается и электрофоретическая подвижность белков, а следовательно, увеличивается продолжительность электрофореза.
В простом варианте электрофореза желательно наносить белковую смесь на гель в минимальном объеме, чтобы высота исходного слоя препарата была не более 2—3 мм. Выполнить это условие нередко бывает затруднительно ввиду недостаточной концентрации исходного препарата. На основании приведенных выше цифр легко рассчитать, что концентрация белка в препарате должна составлять 3—5 мг/мл. Ряд мер позволяет обойти эту трудность; они направлены на концентрирование белкового препарата в узкую зону в момент вступления его в рабочий гель. Основной прием заключается в том, чтобы создать перед гелем область с повышенной напряженностью поля, где белки мигрируют намного быстрее, чем в рабочем геле. В момент перехода из этой области в рабочий гель они будут стягиваться в узкую полосу, так как находившиеся первоначально далеко позади
Рис. 16. Концентрирующий эффект электрофореза в градиентном геле (4— 30% ПААГ)
а — начало фракционирования белков сыворотки; б — тот же гель после 60 ч диффузии при комнатной температуре и выключенном напряжении; в — через 6 ч после возобновления электрофореза
молекулы белка «догонят» впереди идущие молекулы, замедлившие свое движение при вступлении в рабочий гель.
Область с повышенной напряженностью поля можно создать в крупнопористом геле, полимеризованном в буфере с малоподвижными ионами (см. выше, вариант 2). Такой подход использован в системе ступенчатого электрофореза, рассмотренного ниже. Этого же можно добиться и путем растворения исходного препарата белка в том же рабочем буфере, но в 5—10 раз менее концентрированном (вариант 1). Нанесение препарата на гель в разбавленном рабочем буфере нашло широкое применение в силу простоты и достаточно хорошей эффективности этого приема.
Предыдущая << 1 .. 13 14 15 16 17 18 < 19 > 20 21 22 23 24 25 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed