Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование" -> 29

Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование — М.: Наука, 1981. — 288 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforeziultracentrifiguriya1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 23 24 25 26 27 28 < 29 > 30 31 32 33 34 35 .. 130 >> Следующая

Электрофорез белков в комплексе с ДДС-Na был успешно использован для фракционирования белков хроматина без их предварительной очистки. Хроматин диализовали в течение 12 ч против 0,01 М Na-фосфата с 1% ДДС-Na и 1% р-меркаптоэта-нола при комнатной температуре, а затем еще 12 ч — против свежей порции такого же раствора при 37°. Только после этого его прогревали в течение 3 мин при 100° и диализовали еще 2 раза по 12 ч против того же буфера, но содержащего вдесятеро меньше ДДС-Na и p-меркаптоэтанола. При такой обработке ДНК отделяется от белка й не мешает протеканию последующего электрофореза белков хроматина [Elgin, 1975].
3 Л. А. Остерман
ступенчатый электрофорез
(DISC-ELECTROPHORESIS)
Отличительной особенностью этой системы является полимеризация в одной трубке или пластине двух гелей: рабочего, мелкопористого, и непосредственно над ним — «формирующего», крупнопористого. Кроме степени пористости, эти два геля резко различаются по pH и молярности буферов, в которых они поли-меризуются. Отсюда и название системы — ступенчатый электрофорез. По-английски его сокращенно называют «disc-electro-phoresis» (от слова «discontinuous» — прерывистый). Этот вид электрофореза был предложен Орнстейном и Дэвисом еще в самом начале становления метода электрофореза в ПААГ [Ornste-jn, Davis, 1964].
Пористость, длина и выбор буфера для нижнего (рабочего) геля определяются точно такими же соображениями, что и для простого непрерывного электрофореза. Единственное, что здесь своеобразно — это обязательное использование в составе рабочего буфера быстроподвижных ионов, мигрирующих в том же направлении, что и белки, например: иона С1~ для щелочных буферов или иона К+—;для кислых. Выше отмечалось, что использование таких ионов невыгодно, так как приводит к ограничению напряженности поля и скорости миграции белков. Однако в данном случае использование «быстрых» ионов диктуется самим существом метода, как это будет ясно из дальнейшего изложения. Заметим, кстати, что если концентрация этих ионов и зависит от pH буфера, то их электрофоретическая подвижность от pH совершенно не зависит.
В формирующем геле небольшой протяженности (1—3 см) фракционирования белков не происходит. Наоборот, назначение этого геля — собрать смесь всех белков перед переходом в рабочий гель в одну узкую полосу, толщина которой может составлять сотые доли миллиметра независимо от первоначального объема препарата. Для рабочего геля она является исходной зоной для фракционирования, а это резко повышает его разрешающую способность. Поскольку в формирующем геле белки разделяться не должны, его концентрацию стараются сделать минимальной (71=2,5-=-3). Формирующий гель полимери-зуют обычно в таком же по составу буфере, что и рабочий гель (следовательно, он тоже содержит быстроподвижный ион), однако по концентрации и значению pH эти буферы не одинаковы. Буфер формирующего геля, как правило, почти нейтральный, буфер рабочего геля—щелочной или кислый. Смысл этого различия будет раскрыт ниже.
Важную роль в ступенчатом электрофорезе играет выбор электродного буфера, находящегося в контакте с белковым препаратом и формирующим гелем («верхнего» буфера в случае ‘ использования системы с вертикальным расположением геля). В этом буфере пддвижность иона, мигрирующего в том же наев
правлении, что и белок, должна сильно зависеть от pH. Для этого удобно использовать цвиттерионы, например простые аминокислоты (глицин и 0-аланин). Их изоэлектрические точки ле^ жат в нейтральной области pH (для глицина р/=5,97). При этом диссоциации карбоксила с потерей протона и .появлением отрицательного заряда соответствует р/Со,=2,34, а ионизации концевой аминогруппы с присоединением протона и образованием положительного заряда — р/С„3=9,6. При pH 5,97 все молекулы глицина ионизированы по обоим концам и их суммарный заряд равен нулю.
При сдвиге pH окружающей среды в щелочную сторону происходит нейтрализация части молекул глицина по аминогруппе, в то время как карбоксильные остатки всех молекул сохраняют свой отрицательный заряд. Процесс этот — чисто статистический, и для каждой отдельной молекулы можно говорить только о большей или меньшей вероятности того, что она превратится в отрицательный ион или останется нейтральной. В совокупности же множества молекул при данном pH заряд будет нести вполне определенная их доля. При незначительном сдвиге pH от изоэлектрической точки, например при pH 6,8, эта доля будет очень мала. При рН=р/СВг (9,6), согласно определению рК, уже половина всех молекул должна быть нейтрализована по аминогруппе и, следовательно, заряжена отрицательно. Для фигурирующих ниже значений pH 8,3 и 8,9 количество отрицательных ионов глицина будет меньше 50%, но все-таки значительным.
Описанные, изменения доли заряженных молекул глицина (или аланина) используются в системе ступенчатого электрофореза. Для разных ступеней используют разные буферы, содержащие, однако, в своем составе одно и то же слабое основание или слабую кислоту, обеспечивающие собственно буферный эффект: в щелочной буферной системе, где удобно фракционировать кислые белки, это может быть Трис, а в кислой системе для разделения гистонов — уксусная кислота.
Предыдущая << 1 .. 23 24 25 26 27 28 < 29 > 30 31 32 33 34 35 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed