Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
маленькие фрагменты и погрузите в 2 мл солевого раствора, забуференного
фосфатом (PBS), в полипропиленовой центрифужной пробирке (10 мл) на лед.
294
Глава 11
3. С помощью политронного вращающегося ножа (Kinema-tica, Luzern,
Швейцария) гомогенизируйте ткань хвоста. Регулятор скорости установите в
положения 4-5. Введите пестик в пробирку с образцом и медленно
перемещайте вверх и вниз, пока ткань хвоста не будет тонко изрублена.
Тщательно удалите следы ткани с лезвия и очистите пестик прежде, чем
гомогенизировать следующий образец.
4. Центрифугируйте при 1000-2000 об/мин в настольной центрифуге в течение
10 мин, осторожно уберите супернатант, ресуспендируйте осадок в 1 мл
буфера А (75 мМ NaCl, 25 мМ ЭДТА при pH 8) и добавьте 1 мл буфера Б (10
мМ трис-НС1 pH 8, 10 мМ ЭДТА, 1% ДСН, 400 мкг/мл протеинкиназы К). Важно
хорошо ресуспенди-ровать сгусток в буфере А до добавления буфера Б, чтобы
обеспечить быстрый лизис клеток и предотвратить деградацию ДНК.
Проинкубируйте лизаты при 37 °С, оставив на ночь, или при 50 °С в течение
3 ч. По нашему опыту, лизис при 50 °С дает ДНК лучшего качества.
Экстрагируйте один раз фенолом и один раз хлороформом. Доведите до 0,3 М
NaCl и осадите, добавив равный объем изопропанола. Извлеките преципитат
маленьким шпателем, отмойте в 70%-ном изопропаноле и растворите в 300-
500 мкл ТЭ-буфера. Эта процедура даст выход ДНК в концентрации 0,5-1
мг/мл. Поскольку предполагается, что все животные относятся к одной
возрастной группе, разброс в концентрации ДНК должен быть незначительным.
Поэтому мы обычно не определяем оптическую плотность образца.
4.2. ДНК из плодов
В некоторых случаях анализ на трансгенность необходимо проводить на
уровне плодов. Например, возможна ситуация, когда определенная генная
конструкция, экспрессируясь во время эмбриогенеза, обусловливает
пренатальную гибель. В этом случае анализ уже родившихся животных
продемонстрирует низкую частоту трансгенных особей.
Количество ДНК, достаточное для- генотипировання индивидуальных плодов,
может быть получено начиная с 8-го дня беременности. Для обычного анализа
мы выделяем ДНК начиная с 10-11 дня (к 11 дню это составляет до 100 мкг).
1. Осторожно разорвите мышцу матки тонким пинцетом и обнажите зародыш.
Удалите децидуальную ткань и тро-фобласт, если отсутствие примеси
материнской ДНК служит существенным условием эксперимента. Выделение ДНК
только из эмбриона имеет преимущество - клетки
Получение трансгенных мышей
295
легче диссоциируются, а полученная ДНК характеризуется более высоким
качеством.
2. Поместите эмбрион в пробирку Eppendorf, содержащую 0,5 мл PBS (эмбрион
10-12 дня), или в 10 мл-пропиле-новую пробирку (с 13 дня), содержащую 2
мл PBS, и гомогенизируйте ткань путем легкого пипетирования
автоматической пипеткой (Gilson pipettman), при этом желтыми концами
пользуйтесь для гомогенизации 10-12 дневных эмбрионов, голубыми-для
эмбрионов более поздних стадий.
3. Центрифугируйте при 1000-2000 об/мин и дальше следуйте прописи для
ткани хвоста с тем исключением, что для эмбрионов концентрация протеиназы
К должна быть 200 мкл/мл в буфере Б.
4.3. Анализ ДНК
Для первоначального анализа на трансгенность предложен ряд разнообразных
методик [3, 13, 14]. Обычно мы пользуемся методом саузерн-блот [9], хотя
дот-блот-гибридизация занимает меньше времени. Дополнительная информация,
источником которой служит первый из методов, в любом случае потребуется
на более позднем этапе. ДНК хвоста следует обработать рест-риктазой,
высвобождающей внутренний фрагмент из интегрированной конструкции ДНК,
или ферментом, делающим в конструкции один разрез. Поскольку тандемное
расположение превалирует, второй способ также даст фрагменты
предсказуемого размера. Если бы трансген содержал последовательности,
присутствующие также и в мышином геноме, можно было бы использовать зонд
ДНК, гибридизующийся как с трансгеном, так и с собственным геном мыши при
условии, что фрагменты, полученные в результате рестрикции, четко
различаются. Это дает дополнительное преимущество при определении точного
числа копий по силе гибридизационного сигнала. Однако следует иметь в
виду, что значительная доля (20-30 %) мышей-основательниц (F0)
представлена мозаиками [15], поэтому оценка числа копий на геном возможна
только в поколении Fi или в следующих поколениях.
После рестрикции и электрофореза в агарозном геле ДНК переносится из геля
на мембрану. Мы находим, что наиболее быстрый и надежный способ блоттинга
и гибридизации - это щелочной перенос [16] на нейлоновые мембраны (Gene
screen plus, Dupont Boston, США) и гибридизация с зондами, меченными
олигонуклеотидной затравкой ([17], гл. 9, разд. 5.2).
296
Глава 11
4.4. Трансгенные мыши и замораживание эмбрионов
Важнейшим условием эффективного ведения линий мышей в виварии служит
четкая нумерация животных прищипыванием пальцев (описано выше) и
правильная регистрация спаривания мышей для разведения. Любому виварию
