Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
3. ДВ трижды 7. ДВ 12 раз
4. H2S04 трижды 8. ДВ (второй сосуд) 12 раз
В конце процедуры через пипетку для удаления остатков воды продувается
струя воздуха. Разумеется, сначала следует убедиться в том, что
заострение получилось удовлетворительным, чтобы зря не тратить время на
отмывку.
308
Глава 12
3J
_
<Х
UZTLZ д
¦ <o)-i~-jrrizi:z g
Рис. 12.3. Игла для переноса ядер.
Д. Разламывание вытянутого капилляра с внешним диаметром 25- 30 мкм.
Показано положение двух стеклянных шариков, сплавленных с концом нити
накаливания микрокузницы. Б. Положение конца пипетки при его оплавлении.
В. Положение конца пипетки для получения острия.
Г. Заостренный конец пипеткн. Д. Удаление шипа на конце для получения
острого края. Е. Законченный конец пипетки сбоку. Ж. Законченный конец
пипетки сверху.
7. После промывания верните пипетку в горизонтальное положение и
ориентируйте кончик, как показано на рис.
12.3, Б.
8. Нагревайте нить накаливания, пока она не начнет менять цвет, а затем
приблизьте конец пипетки к стеклянному шарику на расстояние, достаточное
для того, чтобы сточенная поверхность оплавилась до гладкости, но
отверстие не сузилось.
9. Поверните иглу так, чтобы сточенное отверстие было обращено в
противоположную от наблюдателя сторону (рис. 12.3, Б).
10. Острый край на конце пипетки позволяет проникнуть через блестящую
оболочку, не повреждая мембраны яйца. Слегка уменьшив нагревание,
приведите конец пипетки в контакт со стеклянным шариком на вершине нити,
затем отодвиньте, оттянув на гладком конце пипетки тонкое острие (рис.
12.3,Г). Выключите нагрев и уменьшите острие на конце, слегка прикасаясь
им к верх-
шарика на конце нити
ней и нижнеи поверхностям (рис. 12.3, Д,Е).
11. Продолжая держать пипетку отверстием от оператора, поверните ее в
вертикальное положение на микрокузнице, нагрейте нить до ярко-красного
цвета и сделайте на стержне пипетки, в том месте, где начинается четкое
Трансплантация ядер в яйца
309
расширение, изгиб под углом 5° (рис. 12.2,Б). Это делается для того,
чтобы конец пипетки был на уровне ее плеча, когда она находится в
горизонтальном положении; это позволит пипетке перемещаться по микрокапле
в вертикальной плоскости, не задевая плечом верхнюю поверхность
манипуляционной камеры. Вид окончательно сформированного кончика пипетки
сбоку (так она будет ориентирована на микроманипуляторе) представлен на
рис. 12.3,Е и вид сверху - на рис. 12.3,Ж.
12. Тщательно высушите пипетки в сушильном шкафу и держите в чашке
Петри прикрепленными к полоске Blu-tac, расположенной на дне чашки.
2.5. Яйца и эмбрионы
2.5.1. Линии мышей
При выборе линии мышей для получения яиц следует учесть два момента.
1. Часто возникает необходимость культивировать оперированные яйца
одноклеточной стадии в течение нескольких дней, прежде чем приступить к
следующему этапу эксперимента. Однако известно, что у мышей большинства
линий развитие яиц in vitro блокируется на 2-клеточной стадии (см. гл. 2,
разд. 2.2.1). Исключение составляют гибридные эмбрионы, полученные на
основе C57BL. Вот почему в качестве донора яиц мы обычно используем Fi от
скрещивания самок C57BL/6J с самцами СВА/Са (те и другие от Bantin and
Kingman).
2. При анализе результатов эксперимента удобно для доказательства
функциональности трансплантированного ядра использовать такие маркеры,
как окраска шерсти или ферментативная активность. Например, животные Fi
от скрещивания C57BLXCBA имеют окраску черную агути (АВ/аВ) и являются
гомозиготами по В-форме глюкозо-фосфатизомеразы (ГФИ-1В) [8]. Для
обеспечения надлежащего контраста с ними скрещивают мышей аутбредной
альбиносной линии (CFLP), которые в результате тщательного скрининга и
скрещиваний стали гомозиготными по изозиму А ГФИ. Анализ фермента
проводят на целлюлозно-ацетатных пластинках с использованием Titan-
системы, поставляемой Helena Laboratories. Яйца от самок Fj, спаренных с
самцами CFLP используются для получения андрогенетических или
гиногенетических яиц.
310
Глава 12
2.5.2. Оплодотворение яйцв
Чтобы получить максимальное число яиц, у самок Fi (в возрасте примерно 28
дней) индуцируют суперовуляцию, инъецируя внутрибрюшинно 7,5 ME ГСЖК, а
затем через 46-48 ч 7,5 ME чХГ. Сразу после этого самок подсаживают к
самцам, одну самку к одному самцу (см. гл. 1, разд. 5.4). Время инъекции
зависит от требующейся стадии пронуклеуса, например, инъекция в 16.30
дает возможность получить яйца с мигрирующими от поверхности
пронуклеусами к середине следующего дня. На следующее утро самок
проверяют на наличие копулятивной пробки.
Яйца с пронуклеусами получают от самок утром первого дня беременности и
освобождают их от клеток кумулюса гиалуро-нидазой, как описано в гл. 2,
разд. 2.1.
2.5.3. Активирование яиц
Яйца для активации обычно получают от гибридных самок C57BL/CBA. Это
объясняется, во-первых, отсутствием у таких яиц блока на 2-клеточной
стадии и, во-вторых, тем, что именно для мышей этой гибридной комбинации
