Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
периодически начинает угрожать перенаселенность. Решить проблему можно
путем замораживания эмбрионов. Этот прием позволяет сохранить трансгенные
линии, не используемые в данное время (см. гл. 13). Еще один способ
сохранения мышей ценных линий - внедрение их в виварни родственных
лабораторий в других институтах.
5. Перенос генов с помощью ретровирусов
Как указывалось выше, ретровирусы используются для получения трансгенных
мышей путем воздействия инфекционным вирусом на предимплантационных
эмбрионов [1]. При этом частота трансформации зародышевой линии близка к
той, которую мы наблюдаем при микроинъекциях ДНК, а сама техника
эксперимента намного проще. Ранние морулы освобождаются от блестящей
оболочки, подвергаются кратковременному воздействию инфекционным вирусом
и трансплантируются псевдобеременным приемным самкам. Различные способы
ретровирусного генного переноса основаны на получении высокого титра
клеточных линий, продуцирующих вирус. Подробные описания соответствующих
экспериментов можно найти в оригинальных публикациях [13, 18, 19].
Укажем на несколько важных пунктов, отличающих эти два пути трансгенеза.
Трансгенные животные, полученные путем интеграции ретровирусов, всегда
являются мозаиками с одним или более сайтов интеграции в различных
клетках. Это обусловлено тем, что эмбрионы обычно инфицируются на стадии
морулы, состоящей из 8-16 клеток [1, 20]. Вот почему для обнаружения
потомства, несущего вставочную последовательность, полученную с помощью
ретровирусов, необходим скрининг. В то же время трансгенные животные,
полученные путем инъекции ДНК в пронуклеусы, в большинстве случаев не
мозаичны и соответственно передают новый ген 50% потомков [15].
Ретровирусы обычно интегрируются в виде единственной копии генов в разные
сайты генома хозяина и не вызывают перестроек ДНК в месте вставки, что
часто наблюдается при инъекции ДНК [21, 22]. Следовательно, они позволяют
более четко интерпретировать позиционные эффекты, обусловленные местом
интеграции чужеродной ДНК [23] и облегчают клонирование сайта инсерции
(вставки), что особенно важно для молекулярного анализа инсерционных
мутаций [24]. Поскольку сигналы
Получение трансгенных мышей
297
контроля транскрипции самих вирусов в разнообразных тканях и особенно в
клетках ранних эмбрионов слабы, для обеспечения как повсеместной, так и
тканеспецифической экспрессии введенных генов использованы ретровирусные
векторы, несущие соответствующие промоторы и энхансеры [25, 26].
Насколько широко может быть применен этот подход, еще предстоит оценить.
Особенно интересно проследить, можно ли добиться с помощью ретровирусных
векторов высокой степени тканевой специфичности (наблюдаемой при
использовании различных конструкций ДНК), несмотря на наличие вирусных
последовательностей контроля транскрипции в непосредственной близости от
введенного гена. Важно помнить также, что существует связанное с
упаковкой ограничение длины геномной РНК вируса, ее максимум
предполагается в пределах 8-10 тысяч оснований [27]. Во всяком случае,
очевидно, что такие гены, как, например, ген мышечной дистрофии Дюшенна с
размером мРНК 14 тысяч оснований [28], невозможно перенести с помощью
ретровирусных векторов, но легко инъецировать в яйца. Следует также
заметить, что конструирование ретровирусных векторов не столь тривиальная
процедура, как получение плаз-мидных векторов для микроинъекции.
Важное преимущество использования ретровирусов заключается в возможности
их введения в эмбрионы более поздних стадий развития, чем
предимплантационные, а также в специфические ткани взрослого животного
[29, 30]. При инфекции клеток на разных этапах дифференцировки вирус
может оказаться уникальным маркером потомков отдельных клеток,
позволяющим прослеживать судьбу клеточных линий [31-41]. Этот подход
очень перспективен при анализе сложных линейных отношений у эмбрионов
млекопитающих и в тканях взрослых животных, например кроветворной ткани.
Возможность избирательного введения генов с • помощью ретровирусов в
кроветворную ткань взрослых организмов позволяет надеяться на реальность
исправления дефектов, обусловленных единичным геном, таких, например, как
синдром комбинированного иммунодефицита [35]. В настоящее время уже
разработаны методики, обеспечивающие высокую эффективность трансформации
стволовых клеток гемопоэза [32], однако прежде, чем приступить к
обсуждению практических вопросов применения в клинике, необходимо решить
ряд проблем, касающихся стабильности экспрессии и безопасности.
Другой подход к трансформации эмбриональных линий у мыши в последнее
время разрабатывается Эвансом с сотрудниками [18, 36]. Культивируемые
эмбриональные стволовые клетки инфицируют ретровирусными векторами,
поддерживают в культуре, а затем вводят мыши путем инъекции в бластоцисту
298
Глава 11
[18]. Использование ЭС-клеток позволит успешно контролировать число
ретровирусных инсерций и, чго более существенно, выделять специфические
