Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
который разрезает вставку в сайте, располагающемся на расстоянии
требуемого числа оснований ниже по ходу считывания от сайта инициации.
Следует отметить, что более короткие зонды включают радиоактивные
нуклеотиды менее эффективно.
3. Подготовка стекол
Наиболее существенная проблема, которая встает при применении
гибридизации in situ к тканям млекопитающих,- вероятность потери среза с
предметного стекла на некоторых стадиях процедуры, в частности, при
отмывке негибридизован-ного зонда. Различные ткани обладают разной
степенью адгезии к стеклу. Судя по нашему опыту, срезы семенников мыши
остаются в одном положении в течение всего воздействия. Срезы мышиной
печени или эмбрионы, напротив, сохраняются хуже. В ряде случаев для
удержания срезов на стекле бывает достаточно покрыть их раствором
желатины с хромовыми квасцами, однако наилучшая адгезия обеспечивается
нанесением полилизина.
Тщательно очистите стекла в хромпике или спирте, затем покройте слоем
поли-Ь-лизина в концентрации 100 мкг/мл. Наиболее эффективный способ
покрытия стекол заключается в использовании обычного распылителя краски
(Badger Air Brush Co., IL), создающего на поверхности стекол тонкий и
ровный слой. Другой способ - погружение стекол в сосуд Коплина с этим
раствором на 3 сек и затем высушивание в вертикальном положении на
специальной подставке. Стекла, покрытые желатиной, готовятся погружением
в раствор 0,5 г желатины, 0,5 г хромовых квасцов (растворенных при 60 °С
в 200 мл дистиллированной воды).
Гибридизация in situ с мРНК на гистологических срезах
265
Таблица 10.2. Подготовка ткаии для получении парафиновых срезов
Число воздействий1) Раствор Время (мин) Температура ГС) Цель
воздействия
7 Изопропанол 10 40 Дегидратация
1 Ксилол 14 40 Промежуточная
1 Ксилол 20 40 среда
1 Парафин 14 60 Пропитывание
3 Парафин 20 60
1) Переносы в свежий раствор.
4. Фиксация и приготовление срезов
Парафиновые срезы хорошо сохраняют клеточную морфологию, но для
гибридизации зондов in situ недостаточно чувствительны. Замороженные
образцы обычно дают более сильный сигнал, однако уровень разрешения
морфологии клетки, обеспечиваемый такими срезами, не всегда достаточен
для окончательных выводов. Например, замороженные срезы не дают
адекватного разрешения, позволяющего различать промежуточные типы клеток
при сперматогенезе. Таким образом, исследователю в зависимости от цели
эксперимента необходимо выбирать между четкой морфологией и
гибридизационной чувствительностью.
4.1. Парафиновые срезы
1. Немедленно погрузите отпрепарированную ткань в 10%-ный формалин, 150
мМ хлорид натрия и фиксируйте не менее, чем 5 ч до приготовления срезов.
2. Сделайте предварительную проводку (см. табл. 10.2) в условиях
меняющегося давления вакуумной системы (это повышает эффективность
пропитывания парафином).
3. После заливки сделайте на микротоме срезы толщиной 2-3 мкм и поместите
их на поверхность теплой воды, нанесенной на стекла, обработанные
указанным способом.
4. Держите стекла в пыленепроницаемой коробке для препаратов. Они могут
храниться до использования по меньшей мере 6 мес.
4.2. Замороженные срезы
1. Заморозьте ткань в жидком азоте и погрузите в каплю Tissue-Tek ОСТ
(Lab-Tek Products, Illinois).
2. Повысьте температуру до -30°С и оставьте ткань в замораживающем
криостате на 1 ч.
4S
268
Глава 10
кированию на срезах основных групп нерастворимых белков, способных
связывать меченую РНК [17]. Неспецифи-^ское связывание зонда может быть
также снижено погружением препаратов в раствор гепарина 50 мкг/мл на 5
мин непосредственно перед внесением зонда и путем включения гепарина в
гибридизационный буфер в концентрации 50 мкг/мл [18]. Гепарин проявляет
способность к стехиометрическому аффинному связыванию ДНК-связы-вающих
белков.
6. Гибридизация
Гибридизационную смесь, содержащую меченый зонд, следует наносить на
гистологические срезы на стеклах согласно указаниям табл. 10.4.
Оптимальная концентрация зонда, дающая лучший ответ на присутствующий в
ткани сигнал, - это концентрация, как раз достаточная для насыщения РНК-
ми-шеней. В случае большинства реакций зонд в концентрации 0,5 мкг/мл
насытит клеточную РНК. Рассчитано, что насыщение РНК происходит при 0,2-
0,3 мкг/мл зонда на 1 т. п. н. длины зонда [9].
7. Постгибридизационные отмывки
Процедуры отмывки описаны в таблице 10.5
8. Радиоавтография
После удаления негибридизованного зонда стекла покрывают тонким слоем
жидкой эмульсии для радиоавтографии, как описано в табл. 10.6. Тип
использованной эмульсии зависит от изотопа. 32Р для этого типа
радиоавтографии не подходит из-за высокой энергии излучения и длинного
пути пробега частиц. Для 3Н и 35S рекомендуются эмульсии Ilford К-2 или
Kodak NTB-2, имеющие размер зерен соответственно 0,2 и 0,26 мкм. Эти
эмульсии не накапливают фон так быстро, как другие [19], однако их нельзя
хранить более 3 мес при 4°С. Вместо жидкой эмульсии можно использовать
пленку Kodak AR-10. Ею сложнее пользоваться, но эта пленка, уменьшает
