Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
кончик иглы в детергент NP-40 (Sigma) и отмойте, опустив его затем в две
порции дистиллированной воды.
5. Поднимите иглу (в лейцевском инструментодержателе) горизонтально на
микрокузницу (см. в гл. 12, разд. 2.3.2' описание микрокузницы и ее нити
накаливания) и рассмотрите кончик иглы. Сломайте конец иглы о стеклянный:
288
Глава 11
37° по меньшей мере 15 мин. В каждую каплю серии, находящейся в
манипуляционной камере, поместите по 2 яйца. Число яиц, набранных в
камеру, не должно превышать количества, которое вы можете спокойно
прооперировать за 20 мин. Более длительное выдерживание яиц вне
инкубатора может их повредить. Каждая группа обычно ограничивается 15-20
яйцами.
3. Введите микроинструменты в камеру. Толстостенная игла должна быть
наполнена раствором ДНК из первой капли. Для этого введите иглу в каплю и
отрегулируйте высоту манипулятора так, чтобы кончик иглы оказался в
фокусе. Заполните иглу, сообщив шприцу де Фонбрюна отрицательное
давление. Наблюдая этот процесс с объективом X Ю, можно видеть, как
отступает масло и в иглу входит раствор ДНК; заполнение иглы маслом
следует закончить, когда мениск окажется на краю поля зрения.
Уравновесьте давление, затем, приложив небольшое положительное давление,
убедитесь в том, что ДНК свободно вытекает. Уберите иглу из капли ДНК-
•4. Передвиньте камеру так, чтобы в поле зрения оказалась первая капля с
яйцами. Поместите яйца в фокус.
5. Введите в каплю инструменты и, регулируя высоту манипулятора,
поместите их в фокус. Будьте осторожны, не сломайте инструменты. Замените
объектив X10 на объектив Х25 и отрегулируйте фокусное расстояние.
6. С помощью рычагов управления манипулятора ориентируйте яйца так, чтобы
оба пронуклеуса были в фокусе, при этом мужской пронуклеус находился бы
ближе к инъекционной игле (рис. 11.2,Л). Мужской пронуклеус располагается
дальше от полярного тельца, кроме того, он имеет большие размеры, чем
женский, и поэтому более удобен для проведения микроинъекций.
7. Захватите яйцо удерживающей пипеткой, приложив к
шприцу Агла небольшое отрицательное давление.
8. Надежно удерживая яйца, поставьте мембрану пронуклеуса (и ядрышки) в
фокус регулировкой высоты манипулятора (рис. 11.2,5).
9. Поместите кончик инъекционной иглы в фокус и с помощью рычагов
управления манипулятора введите в пронуклеус (рис. 11.2,5). Если конец
инъекционной иглы лежит в нужной плоскости, можно видеть деформацию
пронуклеарной мембраны. Если игла не прошла, после попытки инъекции ДНК
появляются "пузырьки" раствора ДНК, окруженные вдавленными ядерной и
яйцевой мембранами (рис. 11.2,5). Для прокалывания мембран часто
требуется короткий, резкий укол.
Получение трансгенных мышей
289
Рис. 11.2. Инъекция в мужской пронуклеус. А. Идентификация мужского и
женского пронуклеусов (Ям- ядерная мембрана, Ядр - ядрышко, Пт - 2-е
полярное тельце). Б. Захватите яйцо удерживающей пипеткой-присоской.
Кончик инъекционной пипетки расположите на одной линии с мужским
пронуклеусом. В. Введите иглу в пронуклеус. Г. Инъецируйте ДНК. Игла еще
не проколола мембраны яйца и пронуклеуса, о чем можно судить по
"пузырьку" у кончика иглы и по ямке, образуемой мембраной яйца в
результате поступления в перивителлиновое пространство жидкости,
предназначенной для пронуклеуса. Д. Осторожно сделайте укол и инъецируйте
еще порцию; увеличившийся объем пронуклеуса свидетельствует об успешной
инъекции. Е. После удаления иглы объем пронуклеуса восстанавливается до
первоначального размера.
19-171
290
Глава 11
Рис. 11.3. Неудачи, возможные при инъецировании. А. Одно лизировавшее и
два здоровых яйца через 30 мин после инъекции. Б. Яйцо с цитоплазмой,
излившейся через инъекционное отверстие под блестящую оболочку, 30 мик
после ииъекцнн. Это яйцо не лизировало полностью, однако не будет
дробиться. В. Ядрышко, вытолкнутое из яйца инъекционной иглой после
инъекции ДНК. Г. Ядрышко, вышедшее в цитоплазму через второе отверстие в
про-
нуклеарион мембране.
10. Если нет сомнений в том, что кончик иглы попал в пронуклеус,
приложите к инъекционной игле положительное давление. Пронуклеус
несколько разбухнет (рис. 11.2,Д). Позже его объем сократится до обычных
размеров (рис. 11.2, Е).
11. Выведите инъекционную иглу и повторите процедуру с другим яйцом.
12. После того как все яйца, находящиеся в камере, будут инъецированы,
соберите их в одну каплю РВ1 и культивируйте в инкубаторе.
13. Возьмите следующую партию свежих яиц из тех, что находятся в РВ1 в
инкубаторе, в капли камеры и повторите процедуру. Для каждой партии яиц
обычно используется новая инъекционная игла.
14. В конце эксперимента отделите удачно прооперированные яйца от
лизировавших (рис. 11.3,Л). Промойте их проводкой по 6 каплям среды М16 +
БСА и оставьте на ночь в капле М16+БСА при 37°С с 5% С02 в воздухе.
Получение трансгениых мышей
291
3.4. Возможные затруднения
Большинство проблем, возникающих при микроинъекциях, связано с
закупориванием инъекционной иглы. Это может быть следствием многих
