Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
благодаря исключительно низкому уровню энергии излучаемых им (3-частиц.
Длина пробега частиц в ра-диоавтографической эмульсии составляет менее 1
мкм, поэтому положение зерна серебра на автографе точно указывает
локализацию радиоактивной молекулы. Однако из-за низкой удельной
активности и низкой энергии излучения трития для получения заметного
сигнала требуется экспозиция в течение нескольких недель или даже
месяцев.
Эту проблему можно обойти, используя вместо трития метку 35S. Зонды с
высокой удельной активностью дают хорошее разрешение на уровне клетки.
Несмотря на то что длина пробега излучений в этом случае больше, чем у
трития, и составляет "20 мкм, радиоавтографическое разрешение можно
повысить до 4 мкм, используя тонкие эмульсии. Для получения четких
результатов потребуются дни, а не недели. Еще одна проблема заключается в
том, что применение зондов, меченных 35S, повышает уровень фонового
мечения, однако система РНК-зон-дирования позволяет использовать РНКазу
для удаления негиб-ридизованного зонда, разрешая тем самым и эту
проблему.
В заключение заметим, что для точной локализации РНК в клетке вполне
подходят зонды, меченные тритием, но для выявления в клеточной популяции
клеток с соответствующими молекулами лучше использовать 35S. Некоторые
исследователи включают следовые количества [32P]-UTP в реакцию синтеза
зондов, меченных 3Н или 35S. В этом случае на срезах можно обычным путем
изучать гибридизацию с помощью рентгеновской пленки, а затем на те из
них, которые покажут положительную гибридизацию, нанести жидкую эмульсию
для лучшего разрешения.
Для локализации гибридизации in situ были разработаны и
нерадиоавтографические приемы исследования. Они подразумевают
использование зондов, меченных биотином, который выявляется с помощью
биотин-специфических антител, конъюгированных с флуоресцентным или
ферментным реагентом [14]. По мнению некоторых исследователей,
биотинилированные зонды обеспечивают большую чувствительность по
сравнению с
Гибридизация in situ с мРНК на гистологических срезах
261
радиоактивными [5], однако такая точка зрения разделяется далеко не всеми
[8]. Очевидное преимущество зондов, меченных биотином, заключается в том,
что с их помощью сигнал гибридизации можно регистрировать в тот же самый
день, когда сделана отмывка. Тем не менее все опубликованные результаты
гибридизации in situ с РНК эмбрионов Drosophila были получены на основе
радиоавтографической техники. Детальное описание гибридизации с помощью
биотин-меченвдх зондов приведено в работе [15]. V;-
2.3. Приготовление радиоактивных зондов
Для того чтобы синтезировать одноцепочечные РНК-зонды с использованием
векторов Bluescript или SP6, нужная плазмида должна быть переведена в
линейную форму с помощью фермента, расщепляющего ниже по ходу считывания
от вставки в сайте клонирования. Если не требуется зонд полной длины,
укороченный зонд можно получить с помощью рестрикта-зы, разрезающей в
пределах вставочной последовательности. Продукт реакции экстрагируется
фенолом, ДНК осаждается этанолом и используется в качестве матрицы для
транскрипции.
Совершенно необходимое условие получения зонда - такая ориентация
вставки, при которой синтезируемая цепь будет комплементарна
соответствующей молекуле мРНК- Для характеристики синтезируемой молекулы
используют метод нозерн-блот (Northern blot analysis) (рис. 10.1).
Все реакции по получению РНК-зондов очень чувствительны к рибонуклеазе,
поэтому важно автоклавировать пробирки и пипетки. Для приготовления всех
буферов нужно использовать бидистиллированную воду, обработанную 0,1%-ным
диэтилпиро карбонатом (ДЭПК). Работать следует только в перчатках, чтобы
не внести рибонуклеазу.
Процедура синтеза радиоактивного одноцепочечного РНК-зонда представлена в
табл. 10.1.
2.4. Расчет удельной активности зонда
Масса синтезированного зонда и его удельная активность могут быть
рассчитаны по процентному содержанию включенных нуклеотидов. Включение
определяется путем осаждения трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Фильтры,
содержащие образец зонда (табл. 10.1, пп.3 и 6), отмойте последовательно
в 5%-ной ТХУ в 5%-ной ТХУ с 0,5% -ным тетранатрийпирофос-фатом и в 90%-
ном этаноле (по 1 мин). Высушите и определите радиоактивность в
сцинтилляционном счетчике. Включение обычно составляет от 30 до 70%.
Масса получен-
264
Глава 10
2. Нейтрализуйте образцы внесением ацетата натрия pH 6,0 до 0,1 мМ и
ледяной уксусной кислоты до 0,5% (о/о).
Нужное для гидролиза время рассчитывается по формуле
^ U - Lf
kLo-Lf
где t - время в мин, L0 - первоначальная длина фрагмента в т. п. н., Lf -
конечная длина фрагмента в т. п.н., k - постоянная скорости гидролиза,
составляющая около 0,11 т. п. н./мин.
Длина зонда может быть измерена прямо путем электрофореза в 4%-ном
агарозном геле (Nusieve, Miles Scientific, UK), содержащем 0,1% ДСН, или
в 10%-ном полиакриламидном геле с 8 М мочевиной при 60°С.
Укороченные зонды можно также получить, обрабатывая плазмиду ферментом,
