Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
Обращаться с БПЛ следует с большой осторожностью, во-первых, потому, что
это потенциальный канцероген, а во-вторых, потому, что при температурах
выше 4°С он крайне лабилен.
1. Разморозьте одну из двух аликвот исходного раствора препарата вируса и
воспользуйтесь вортексом.
2. Отцентрнфугируйте при 35000g" в течение 30 мин. Ресус-
пендируйте осадок в 0,9 мл раствора Хенкса без глюкозы и диспергируйте с
помощью вортекса.
3. Перенесите раствор в пробирку с хорошо подогнанной пробкой и добавьте
5 мг БСА.
Дальше процедура ведется в холодной комнате, чтобы избежать потери
активности очень нестойкого БПЛ. Учитывая высо-
Трансплантация ядер в яйца
303
кую токсичность этого соединения, рекомендуем надеть две пары перчаток и
защитную одежду, включая маску. Все растворы следует приготовить и
проверить до переноса в холодную комнату, чтобы до минимума сократить
время работы с БПЛ. Все растворы держать на льду.
4. В холодной комнате прежде всего добавьте 20 мкл БПЛ к 162 мкл воды,
дважды дистиллированной в стеклянной посуде.
5. Быстро внесите 50 мкл этого раствора в 0,95 мл солевого раствора (1,68
г NaHCC>3+0,85 г NaCl + 0,2 мл 0,5%-ного фенолового красного +100 мл
воды, дважды дистиллированной в стеклянной посуде).
¦6. Быстро добавьте 100 мкл полученного на предыдущей стадии раствора к
0,9 мл препарата вируса (т. е. после п. 3, см. выше).
7. Держите пробирку на льду; перемешайте содержимое с помощью вортекса
(частота интервалов 10-15 мин), обеспечивающего тщательное перемешивание
в плотно закрытой пробирке.
-8. Поместите пробирку на 2 ч на медленно вращающийся круг при 37 °С;
инкубируйте всю ночь при 4 °С для обеспечения полного гидролиза БПЛ.
¦9. Приготовьте аликвоты инактивированного вируса Сендай объемом 20 мкл в
пробирках Eppendorf, заморозьте в сухом льду и храните при -70 °С. При
таком способе хра-.нения инактивированный вирус Сендай не теряет свойство
фузогенности в течение по меньшей мере 1 года.
10. Когда потребуется, разморозьте аликвоту вируса Сендай и разведите
ее раствором Хенкса без глюкозы до концентрации 1000-10 000 ГАЕ/мл.
Поскольку фузогенная активность разных партий вируса Сендай может
варьировать в довольно широких пределах, а также в связи с отсутствием
четкой зависимости между титром ГАЕ и фузогенностью вируса, степень
разведения определяется в ходе предварительных экспериментов. Высокая
концентрация фузогенного вирусного препарата может вызвать интенсивный
лизис клеток, низкая же, напротив, не обеспечит эффективного слияния
клеток. Судя по нашему опыту, разведенный препарат вируса Сендай в
течение недели не теряет фузогенной активности, если препарат хранится
при 4°С.
304
Глава 12
2.3. Оборудование
2.3.1. Микроманипупяционная установка
Мы пользуемся стандартным лейцевским микроманипулятором [7] с
фиксированным микроскопом Ergaval (Carl Zeiss, Jena) и выпрямляющей
изображение интерференционной оптикой Номарского. Микроскоп укомплектован
объективами Х10 и Х32 с большим рабочим расстоянием и широкопольными
окулярами X 10 (см. также гл. 3; разд. 7.1).
Положительное и отрицательное давление в рабочем инструменте регулируется
микродозаторным насосом де Фонбрюна (Beaudouin, Paris), а в удерживающем
инструменте с помощью простого 2 мл-шприца Wellcome Agla. Благодаря тому
что пластиковые трубки, входящие в систему, прозрачны, мы имеем
возможность обнаружить в ней пузырьки воздуха. Ригидность трубок
достаточна для того, чтобы рабочее давление подавалось на кончик пипетки,
не поглощаясь стенками трубки.
Стеклянные рабочие инструменты присоединяются к стандартным лейцевским
трубкам, которые фиксируются в инструментальной головке манипулятора.
Шприц и трубки заполняют тяжелым жидким парафиновым маслом, при этом
следует избегать попадания пузырьков воздуха в систему.
Микроманипуляции проводят в висячей капле в лейцевской (Puliv)
микроманипуляционной камере (внутренняя высота 3 мм), заполненной тяжелым
жидким парафиновым маслом. Камеры сразу после использования отмывают
горячей водой, а затем спиртом и хранят завернутыми в пыленепроницаемый
материал. Покровные стекла, образующие верхнюю поверхность
манипуляционной камеры, по размеру должны точно подходить к ней. Перед
употреблением их очищают спиртом, погружают в силиконовый раствор
(Sigmacote), высушивают на воздухе, снова промывают спиртом и помещают в
горячую печь для снятия статического электричества.
Манипуляционную установку необходимо собрать на устойчивом рабочем столе
на высоте, удобной для работы оператора. Манипуляции желательно проводить
в условиях кондиционированного воздуха, так как высокая температура -
выше 20°С или (71° F) делает клеточные мембраны более липкими, тяжелое
парафиновое масло становится менее вязким, затрудняя работу оператора и
повышая число неудачных операций.
2.3.2. Другое оборудование
Для работы с яйцами, для загрузки и разгрузки манипуляционных камер
рекомендуется стандартный просвечивающий микроскоп, например Wild М5.
