Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
срезов, Кену Меррифилду за помощь в публикации и Кристине Уотсон за
критический анализ рукописи. Эта работа была обеспечена грантом,
полученным Институтом исследований рака от Объединенного комитета
MRC/CRC. Ребекка Хаффнер - стипендиатка Совета медицинских исследований
(MRC).
Литература
1; Gall J. О., Pardue М. L. (1969). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63, 378.
2. Gall J. G., Pardue M. L. (1971). In: Methods in Enzymology.
Academic Press, New York, Vol. 21, p. 470.
Гибридизация in situ с мРНК на гистологических срезах
277
3. Siracusa L. D., Chapman V. М., Bennett К. L" Hastie N. D., Ptetras D.
F., Rossant J. (1983). J. Embryol. Exp. Morphol., 73, 163.
4. Rossant I., Vijh M" Siracusa L. D" Chapman V. M. (1983). J. Embryol.
Exp. Morphol., 73, 179.
5. Lo C. W. (1986). J. Cell Sci., 87, 143.
6. Hajen E., Levine М., Garber R. L., Gehring W. J. (1983). EMBO J., 2,
617.
7. Awgulewitsch A., Utset M. F., Hart C. P., McGinnis W" Ruddle F. H.
(1986). Nature, 320, 328.
8. Pardue M. L. (1985). In: Nucleic Acid Hybridisation: A Practical
Approach. Hames B. D. and Higgins S. J. (eds), IRL Press, Oxford, p. 179.
9. Сох К. H., DeLeon D. V., Angerer L. М., Angerer R. L. (1984). Dev.
Biol., 101, 485.
10. Akam М. E. (1983), EMBO J., 2, 2075.
11. Melton D. A., Krieg P. A., Rebagliati M. R., Maniatis Т., Zinn K"
Green M. R. (1984). Nucleic Acids Res., 12, 7035.
12. Uhl G. R" Zingg H. H., Habener 3. F. (1985). Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 82 5555
13. Berger C. N. (1986). EMBO J., 5, 85.
14. Leary J. ]., Btigati D. J., Ward D. C. (1981). Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 78, 6633.
15. Brigati D. J., Myerson D., Leary J. J., Spalholtz B., Travis S. J.,
Fong С. K., Hsiung G. D., Ward D.C. (1983). Virology, 126, 32.
16. Zinn K" DiMaio D" Maniatis T. (1983). Cell, 34, 865.
17. Hayashi S., Gillam I. C" Delany A. D., Tener G. M. (1978). J.
Histochem.,
26, 677.
18. Singh L., Jones K. W. (1984). Nucleic Acids Res., 12, 5627.
19. Rodgers A. W. (1979). Practical Autoradiography. Review 20, Amersham
International pic, Amersham, UK.
20. Dormer P., Pachmann K., Lau B. (1978). Histochemistry, 59, 17.
21. Willison K. R" Dudley R., Potter J. (1986). Cell, 44, 727.
22. Gizang-Ginsburg E" Wolgemuth D. J. (1985). Dev. Biol., Ill, 293.
280
Глава 11
6. Вырежьте полосу ДНК из агарозы с низкой точкой плавления и удалите
излишки агарозы. Поместите гелевую пластинку в соответствующую пробирку и
инкубируйте при 70 °С, пока агароза полностью не расплавится. Определите
объем геля и добавьте 5 объемов 0,5 М NaCI в ТЭ-буфере (10 мМ трис-НС1 pH
7,5, 1 мМ ЭДТА). Хорошо перемешайте и продолжайте инкубировать еще 10 мин
при 70 °С.
Смесь ДНК/агарозы очищается с помощью ион-обменной колонки NACS-52
Prepac(BRL) следующим образом.
1. Проведите гидратацию колонки, промыв ее трижды 2,0 М NaCI в ТЭ-буфере.
Подготовьте колонку, промыв трижды буфером для связывания ДНК (для
фрагментов ДНК больше 1 т. п.н. используйте 0,5 М NaCI в ТЭ-буфере, для
фрагментов меньшего размера возьмите 0,2 М NaCI в ТЭ-буфере).
2. Загрузите колонку теплой (40°С) смесью агарозы/ДНК и отмойте связанную
ДНК связывающим буфером (3- 5 мл при 42 °С) для освобождения от агарозы и
любых гелевых примесей.
3. Элюируйте связанную ДНК 3 объемами по 0,1 мл 2,0 М NaCI в ТЭ-буфере.
4. Осадите ДНК внесением 0,6 мл холодного (-20 °С) 95%-ного этанола. Если
присутствует небольшое количество ДНК (^Ю мкг), его нужно осадить вместе
с тРНК-носителем. Присутствие тРНК в конечном образце ДНК не оказывает
неблагоприятного воздействия на частоту интеграции ДНК или на развитие
зиготы.
5. Отцентрнфугируйте осадок в течение 10 мин при 12 000 об/мин в
микроцентрифуге, затем хорошо отмойте сгусток 70%-ным холодным этанолом
для удаления осажденной соли. Высушите осадок и растворите в небольшом
объеме ТЭ-буфера.
6. Определите абсорбцию препарата при 260 нм и 280 нм (1 ОП26о = 50 мкг
ДНК, ОП260/ОП2 80=1,8 для чистой ДНК). На этой стадии препарат можно
также проконтролировать проведением электрофореза маленькой аликвоты в
агарозном мини-геле.
7. Разведите ДНК до нужной концентрации (см. ниже) буфером для инъекции
(10 мМ трис-НС1 pH 7,6; 0,1 мМ ЭДТА) и диализуйте при 4°С, использовав
большой объем буфера для инъекции и сменив его несколько раз в течение 48
ч.
8. Извлеките ДНК и храните аликвотами по 20 мкл при -20 °С. Для выделения
фрагмента ДНК из агарозных гелей можно воспользоваться и дгугими
методами: электро-
Получение трансгеиных мышей
281
элюцией, методом "сжимания и замораживания", связывания ДНК стеклянной
пудрой. Эти методы описаны [9]. В любом случае необходим интенсивный
диализ образца.
2.1.3. Концентрация ДНК
В большинстве экспериментов используется ДНК в концентрации 1-2 нг/мкл;
это соответствует 200-400 копиям фрагмента ДНК длиной 5 т. п. н., который
и может быть инъецирован в пронуклеус. В этих условиях частота интеграции
ДНК достигает оптимума, т. е. 20-40% [3]. ДНК, введенная в зародышевую
