Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
линию мыши путем микроинъекции в пронуклеус, имеет тенденцию к интеграции
в единственном сайте в виде различного числа тандемно расположенных
копий. Возможно, что подобная молекулярная организация интегрированной
ДНК влияет на ее экспрессию [10]. Число интегрированных копий можно
уменьшить снижением концентрации ДНК, например мыши с единственной
интегрированной копией были получены в результате введения ДНК в очень
низкой концентрации, хотя прямой зависимости при этом не наблюдается.
Однако, снижая концентрацию ДНК, надо помнить, что при этом значительно
падает общая частота интеграции [4]. С другой стороны, применение слишком
высоких концентраций ДНК (например, 10 нг/мкл) резко снижает выживаемость
эмбрионов [3].
В нашей лаборатории для каждой новой конструкции ДНК мы ставим
предварительные эксперименты, в которых прослеживается развитие
инъецированных яиц in vitro до стадии бластоцисты (табл. 11.1). Если
развитие значительной доли Эхмбрио-нов блокируется на одноклеточной
стадии (40% по сравнению с обычными 20%), ДНК разводится в 2 или более
раз. Блок развития не обязательно связан с токсичностью ДНК per se, он
может быть следствием временной экспрессии введенной ДНК- С другой
стороны, высокая временная экспрессия генной конструкции может служить
хорошим тестом для оценки ее интеграции, например, при измерении
активности индикаторных генов, таких, как гены тимидинкиназы [11] или р-
галактозида-зы у 2-клеточных эмбрионов.
2.2. Яйца и эмбрионы
2.2.1. Линии мышей
Выбор линии зависит от того, имеет ли ее генетический фон тгрямое
отношение к предполагаемому использованию трансгенных мышей. Например,
анализ некоторых конструкций иммуноглобулиновых генов или генов главного
комплекса гистосов-
284
Глава 11
Инъекционные иглы обоих типов мы оттягиваем на Model Р-80, Brown Flaming
Micropipette puller (Sutter Instrument Co.), но существуют и другие
приспособления, служащие для оттягивания пипеток. Окончательная форма
придается иглам с помощью микрокузницы Beaudouin (см. гл. 12, разд. 2.3.2
и 2.4).
2.4. Изготовление микроинструментов 2.4.1. Удерживающая пипетка
Изготовление пипетки-присоски для удержания яиц описано в разд. 2.4.1,
гл. 12.
2.4.2. Инъекционные иглы
Инъекционная игла для обработки на микрокузнице де Фон-брюна. Эти иглы
делают из стандартных толстостенных капилляров (из боросиликатного
стекла), наружный диаметр которых 1,0 мм, внутренний диаметр 0,58 мм,
длина 15 см (поставщик Leitz, Clark Electromedical Instruments, Drummond
Scientific Company).
1. Силиконируйте стеклянные капилляры изнутри и снаружи, погружая их в
раствор силикона (Sigmacote, Sigma) и высушивая в сушильном шкафу.
2. Закрепите капилляр в приборе для оттягивания игл и включите его.
Модель Р-80 регулирует четыре параметра; она снабжена регистраторами
скорости, вытяжения, нагревания и воздушного потока. Регистратор
нагревания контролирует температуру платиновой нити, нагревающей
стеклянный капилляр, а поток воздуха охлаждает нить и стекло. Полное
описание всех регуляторов прилагается к инструменту.
Когда регистраторы скорости, вытяжения и нагревания находятся в
постоянном положении, контроль воздушного потока: обеспечивает тонкую
настройку инструмента, позволяющую' придать игле нужную форму. Нужная
настройка воздушного, потока со временем может сбиться, поэтому качество
первых нескольких игл, оттянутых в течение данного дня, следует
проконтролировать в микроскопе, а затем приступить к изготовлению
следующих. Оптимальная форма и размеры иглы приведены на рис. 11.1.
3. Из каждого стеклянного капилляра получаются 2 иглы. Разрежьте его на
фрагменты по 4-5 см алмазным ножом. Мы рекомендуем оттягивать 20-30 игл
для использования в тот же день. Можно было бы приготовить и больший
запас игл и хранить их, пока не понадобятся, но при этом1
Получение трансгенных мышей
285
1 ММ
< - 45 мм-|-
-10-13 мм-
10 мкм
I .
>10 мкм
•250 мкм ........- ¦¦ |
Рнс. 11.1. Схематическое изображение инъекционной иглы (масштаб не
соблюдается). А. Общая форма н оптимальные размеры инъекционной иглы:
длина иглы от плеча диаметром 1 мм до кончика должна составлять от 10 до
13 мм. Как можно ближе к основной трубке иглы необходимо сделать изгиб
5°. Длина основной трубки должна быть около 45 мм. Кончик инъекционной
иглы может быть представлен тремя вариантами (?, В, Г). Б, В - концы
пипеток приемлемой формы: диаметр последних нескольких микронов длины
кончика достаточно мал, чтобы прн вхождении в яйцо не были необратимо
повреждены мембраны. Если игла слишком тонка, она не будет обладать
нужной жесткостью для немедленной реакции на движения манипулятора. Чем
меньше сужение к концу (Б), тем удобнее пользоваться пипеткой Г.
Непригодная форма: игла слишком расширена у конца пипеткн.
иглы собирают пыль, способную закупорить отверстие. Кроме того, замечено,
что со временем края их отверстия становятся менее острыми.
4. Поместите иглы в свободный лейцевский инструментодер-жатель. Погрузите
