Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
3 Добавьте 2 мкл 0,5 М ЭДТА.
¦5. Экстрагируйте один раз смесью фенол: хлороформ (1:1).
5. Удалите невключеиную [4f-32P]-ATP путем хроматографии на колонке
се-фадекса G50 в 10 м.М трис-НС1 pH 7.5; 100 мМ NaC.1; 1 мМ ЭДТА.
Соберите фракции, содержащие первый пик с меченым олигонуклеотидом
B. Мечеиие олигонуклеотидов методом заполнения
Альтернативный способ заключается в мечении олигонуклеотидов путем
синтеза комплементарного олигомера с помощью короткого (обычно 8
оснований) олнгонуклеотида-затравки. Следует очень внимательно подойти к
выбору радиоактивного нуклеотида, чтобы добиться наибольшего числа
Продолжение табл. 9Я
меченых оснований. Это в большой степени зависит от последовательности
олигонуклеотида. Проведите реакцию следующим образом.
1. Отжиг
1 мкл олигонуклеотида (30 иг) - матрицы 1 мкл олигонуклеотида (10 нг)-
затравки 10 мкл ТМ7)-буфера.
2. Инкубируйте при 65 °С в течение 5 мин.
3. Охладите при комнатной температуре в течение 5 мин, затем
кратковременно отцентрнфугируйте.
4. Добавьте по 1 мкл каждого из трех холодных растворов dNTP (при 1 мМ) н
4 мкл (40 мкКи) (Amersham, уд. акт. 3000 Ки/ммоль) последнего "горячего"
основания - [32P]-NTP.
5. Добавьте 4 единицы фрагмента Кленова (ДНК-полимеразы I).
6. Инкубируйте иа льду в течение 2 ч, затем добавьте 1 мкл того же
самого, ио "холодного" основания (при 1 мМ) и инкубируйте иа льду 45 мин.
7. Добавьте 5 мкл деионизированного формамида, нагревайте в течение 5 мин
при 65 °С и затем проводите электрофорез в 10%-ном разделяющем
акрнламидном геле в течение приблизительно 3 ч или до тех пор, пока
краситель бромфеиоловый синий (загруженный в параллельную лунку) не
окажетси на расстоянии "10 см от дна.
8. Заверните гель в липкую ленту, сверху поместите рентгеновскую пленку
(при красном свете) и экспонируйте в течение 2 мии.
9. Проявите пленку, совместите ее с гелем и аккуратно вырежьте меченую
полосу.
10. Снова поместите гель на пленку, чтобы проверить правильность
вырезания полосы. Важно выделить только ту область геля, которая содержит
меченую полосу, чтобы избежать примеси немеченой олигонуклеотидной
матрицы, снижающей эффективность гибридизации.
11. Внесите фрагмент геля в 500 мкл 1 мМ ЭДТА, содержащей 20 мкг ДНК
сонированной спермы лосося. Кратковременно гомогенизируйте, элюируйте в
течение иочи, добавьте непосредственно к гибриднзационному раствору.
Г. Одноцепочечная кДНК из популяций специфической РНК
Процедура получения такой кДНК представляет собой модификацию реакции
синтеза первой цепи для клонирования кДНК с использованием случайных
затравок, приготовленных из сонированной денатурированной ДНК. тимуса
теленка (Pharmacia).
1. Высушите под вакуумом по 50 мкКи (уд. акт. 3000 Ки/ммоль) dCTP н dTTP
плюс 1 мкл актнномицина D8>.
2. Добавьте
5.0 мкл пятикратного буфера обратной транскриптазы9)
2.5 мкл случайной затравки (2 мг/мл)
0,5 мкл дитиотрейтола (1,0 М)
1.0 мкл dTTP (0,1 мМ)
1.0 мкл dCTP (0,1 мМ)
2.5 мкл dGTP (5,0 мМ)
2.5 мкл dATP (5,0 мМ)
1.0 мкл РНКазина (30 единиц)10'
1.0 мкл обратной транскриптазы (22 единицы)1".
Доведите объем до 25,0 мкл бидистиллированной водой.
3. Инкубируйте при 37-42 °С в течение 2 ч.
252
Библиотека кДНК для прсдимплантадиоиного эмбриона мыши
253
Продолжение табл. 9.3
4. Удалите иевключенные нуклеотиды путем хроматографии иа сефадексе G-
50. Кипятите пробу н течение 5 мни, прежде чем добавить к гибриди.ча-
дионному раствору.
') Поставщики SeaKem, Sigma.
2) См. работу [261.
3) Буфер для мечеиия олигонуклеотидов состоит из раствора О: 1,25 М трис-
Нел pH 8.0, 0,125 М MgCW; раствора А: I мл раствора 0+18 мкл 2-
меркаптоэтанола+5 мк.т (1АТР+5 мкл dTTP+5 мкл dGTP (каждый 0,1 М в
бидистиллированной Н20); раствора /г 2 М HEPES (Sigma) pH 6,6; раствора
В: гексадезоксирибонуклеотиды (Phaimacia) в 1" (см. сноску 4) при ОП 90
едиииц/мл. Смешайте растворы А: Б: В в отношении 100 : 250 : 150.
7) ТМ-буфер: 0.1 М трис-НС1 pH 8,0; 0,1 М MgCb-
5) Десятикратный киназный буфер: 0,5 М трис-НС! pH 7,6; 0.1 М MgCU; 50
мМ ;ш-ыютрейтол; ! мМ спермидии; I мМ ЭДТА.
в) Поставляется BRL. Одна единица полинуклеотидкиназы Т4 переносит 1
пмоть V фосфата от АТР к 5'-концу ДНК, обработанной микрококковой
нуклеазой в течение-30 мин при 37°С.
7) ТМ-буфер: 0,1 М трис-HCl pH 8,0; 0,1 М MgCb-
8) Поставляется фирмой Calbiochem. Исходный раствор 1 мг/мл в 80%-ном
(с+о) -*t 't-ноле.
9) Пятикратный буфер ОТ: 250 мМ трис-НС! pH 8.3 (при 42
°С); 40 мМ Mgd .
250 мМ КС1.
,0) Поставляется фирмой Biotech. 1 единица РНКазина ингибирует на 50%
активности-5 нг рибонуклеазы А.
п) Поставляется NBL Enzymes Ltd. 1 единица обратной транскриптазы
вкл:оча*т 1 нмоль dTMP в кислотонерастворимый продукт за 10 мин при 37
°С.
помечены либо ник-трансляцией [31], либо полимеризацией с использованием
случайной затравки [32]. Последней процедуре отдается предпочтение в
связи с тем, что она дает зонд с более высокой удельной активностью. В
случае межвидовой гибридизации требования к отмывке (после процедуры
