Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
тшшлпрованного анти-иммуноглобулина, разведенного в 100 мкл 3%-ного БСА в
PBS, доведите до 0,5 мл. Инкубируйте 45-60 мин.
4 Тщательно промойте блот (4X10 мии), прежде чем инкубировать с 5 мкл
[¦!55]-стрсптавидниа, разведенного в 50 мкл PBS с 3% БСА, в течение 60
Mifi! в закрытом контейнере.
9. Тщательно промойте блот (4x10 мин), высушите на воздухе н
экспонируйте с предварительно засвеченной пленкой при -70° в течение 3-20
сут.
') К'.ждое разведенное антитело следует до использования центрифугировать
при 1SK в г. :сан.' 2-5 мин.
в) биотинилированное вторичное антитело обнаруживается с помощью
третичного антитела-[355]-стрептавидина. Последняя из перечисленных
систем (соответствующие реактивы можно получить от фирмы Amersham)
оказалась наиболее чувствительной и с успехом применяется для
электрофоре-
238
Глава 8
тического разделения белков с последующей амплификацией антител. Эта
система представлена в табл. 8.11.
5. Заключение
Для изучения белков раннего эмбриона применяется электрофорез.
Усовершенствование этого метода позволит идентифицировать, описывать и
выделять специфические белки. Особенно ценным представляется анализ с
помощью двумерных гелей высокого разрешения. Использование электроэлюции
полос специфических белков после электрофореза [37, 38] открывает
возможности анализа индивидуальных белков путем пептидного картирования и
секвенирования аминокислот [3]. Выделение индивидуальных белков позволит
получать антитела, с помощью которых можно будет изучать белки эмбриона
методами иммунофлуоресценции, иммуноблоттинга или иммунопреципитации.
Субфракционирование и/или избирательная солюбилизация помогут связать
присутствие специфических белков с определенными стадиями развития.
Благодарности
Я благодарю за помощь в написании этой главы Азима Су-рани, Эвелин
Хаулистон, Бернара Маро, Боба Моора и Мартина Джонсона.
Литература
1. Johnson М. Н., McConnell ]., Van Blerkom J. (1984). J. Embriol. Exp.
Morphol., 83, suppl. 197.
2. Hames D., Rickwood D., (eds). (1981). Gel Electrophoresis of
Proteins -
A Practical Approach. IRL Press, Oxford.
3. Dunn M. J., Burghes A. H. M. (1983). Electrophoresis, 4, 173.
4. Van Blerkom J. (1978). In: Methods in Mammalian Reproduction.
Daniel J. C., Jr (ed)., Academic Press, New York, p. 68.
5. McConkey E. H. (1979). Anal. Biochem., 96, 39.
6. McConkey E. H. (1982). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 3236.
7. Lecocq R. E., Hepburn A., Lamy F. (1982). Anal. Biochem., 127, 293.
8. MacQueen H. A. (1979). J. Embryol. Exp. Morphol., 52, 203.
9. Schultz G. A., Kaye P. L., McKay D. J., Johnson М. H. (1981). J.
Reprod. Fertil., 61, 387.
10. Bolton V. N.. Oades P. J.. Johnson М. H. (1984). J. Embryol. Exp,
Morphol., 79 139
11. W'hiteley N. M" Berg H. C. (1974). J. Mol. Biol., 87, 541.
12. Johnson L. V.., Calarco P. G. (1980). Dev. Biol., 77, 224.
13. Bolton A. E" Hunter W. M. (1973). Biochem. J" 133, 529.
14. Taylor M. A.. Robinson K. R., Smith L. D. (1985). J. Embryol Exp.
Morphol,, 89, 35.
15. Howletl S. K. (1986). Cell, 45, 387.
Качественный анализ белков ранних эмбрионов мыши
239
16. Johnstone A., Thorpe R. (1982). lmmunochemistry in Practice.
Blackwell Scientific Publications, Oxford.
17. Van Blerkom J. (1981). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7629.
18. SuraniM. A. H. (1979). Cell, 18, 217.
19. Laemmli U. K. (1970). Nature, 227, 680.
20. O'Farrell P. H. (1975). J. Biol. Chein., 250, 4007.
21. Burghes A. H. М., Dunn M. J., Dubowttz V. (1982).
Electrophoresis, 3, 354.
22. O'Farrell P. Z., Goodman H. М., O'Farrell P. II. (1977). Cell, 12,
1193.
23. Garretls J. I. (1983). In: Methods in Enzymology. W. R., Grossmann L"
Moldave K. (eds.), Academic Press, New York, Vol. 100, p. 411.
24. Drysdale J. W. (1975). In: Methods of Protein Separation.
Catsimpoolas N. (ea.), Plenum Press, New York, p. 93.
25. Bonner W. M" Laskey R. A. (1974). Eur. J. Biochem., 46, 83.
26. Laskey R. A. (1984). Radioisotope Detection by Fluorography and
Intensifying Screens. (Review 23), Radiochemical Centre, Amersham, UK-
27. Laskey R. A., Mitts A. D. (1975). Eur. J. Biochem., 56, 335.
28. Switzer R. C., Merril C. R., Shifrin S. (1979). Anal. Biochem.,
98, 231
29. Wray W., Boulikas Т., Wray V. P., Hancock R. (1981). Anal. Biochem.,
118, 197.
30. Furlan М., Perret B. A., Beck E. A. (1979). Anal. Biochem., 96, 208.
31. Wood C. hL, Sarinana F. O. (1975). Anal. Biochem., 69, 320.
32. Glass W. F., Briggs R. C., Hnitica L. S. (1981). Anal Biochem., 115,
219.
33. Burnette W. N. (1981). Anal. Biochem., 112, 195.
34. Anderson N. L" Giometti C. S., Gemmell M. A., Nance S. L., Anderson
N. G. (1982). Clin. Chem., 28, 1084.
35. Olden K., Yamada К. M. (1977). Anal. Biochem., 78, 483.
36. Burridge K. (1978). In: Methods in Enzymology. Ginsburg V. (ed.),
Academic Press, New York, Vol. 50, p. 54.
37. Wallis М. H., Kramer G., Hardesty B, (1980). Biochemistry, 19, 789.
38. Niemann M. S., Volanakis J. E., Mole J. E. (1980). Biochemistry, 19,
