Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 102

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 96 97 98 99 100 101 < 102 > 103 104 105 106 107 108 .. 162 >> Следующая

нитроцеллюлозные или нейлоновые мембранные фильтры. Гибридизация на
фильтрах детально описана в работе [26]. Наше внимание будет
сосредоточено на разнообразных зондах и методах мечения, а также на
альтернативных способах выделения определенных клонов.
5.1. Тест на репрезентативность библиотеки
Очень важно убедиться в том, что эмбрноноспецифические последовательности
присутствуют в библиотеке. Это может быть сделано путем скрининга
одноцепочечиой кДНК с высокой удельной активностью, приготовленной из
мРНК, которая была использована для создания библиотеки. Поскольку данная
процедура требует очень ценную эмбриональную РНК, рекомендуется сделать
предварительный скрининг зондом, кодирующим известную РНК,
экспрессируемую в большинстве типов клеток пли на топ стадии
эмбриогенеза, на которой получен материал библиотеки. На наш взгляд,
целесообразно использовать зонды для таких интенсивно экспрессируемых
мРНК, как р-актиновая.
Скрининг клонами для редких РНК также информативен По его результатам
можно судить о репрезентативности (представительности) библиотеки. На
рис. 9.3 мы видим сигналы гибридизации, полученные в результате
зондирования одной
250
Глава 9
Рис. 9.3. Тест на представительность библиотеки. Пара фильтров с -3000
бляшек библиотеки кДНК ооцита/CPMV была гибридизована с инсер-ционным
(вставочным) фрагментом рРЕ386, радиоактивномеченным с помощью
полимеризации со случайной затравкой (табл. 9.3,71). Этот клон кДНК
содержит 1,1 т. п. н. последовательностей ламинина В1 [29]. Обнаружен 1
положительно гибридизованный клон. Высокий фон является следствием
гибридизации poly(А)-хвостов в клонах библиотеки с poly(А)-
последовательностями
зонда.
пары фильтров из библиотеки ооцита мыши (высеянной при высокой плотности)
клоном кДНК, содержащим 1,1 т. п. и. 3'-концевых последовательностей
ламинина В1 [29]. Полипептид В1 составляет примерно 0,06% белка ооцита
[30]. Относительное содержание соответствующей РНК не известно, однако
число В1-гибридизующихся клонов ооцита примерно в 10 раз ниже числа
актин-гибридизующихся клонов, что хорошо согласуется с результатами
экспериментов, выполненных на уровне белков.
5.2. Скрининг библиотеки для выявления специфических последовательностей
Существует пять основных подходов к скринингу библиотек кДНК, в трех из
них используются зонды нуклеиновых кислот. Методики приготовления зондов
представлены в табл. 9.3.
5.2.1. Клонироввнные зонды
Зонды, состоящие из предварительно клонированных последовательностей,
часто применяются для выделения специфической последовательности из
библиотеки кДНК разных видов или разных стадий развития. Такие ДНК-зопды
могут быть
Таблица 9.3. Приготовление зондов из радиоактивной НК
A. Полимеризация с использованием случайной затравки
Этот метод используется для мечения ДНК, плазмид, содержащих интересующую
последовательность, или специфических фрагментов ДНК, вырезанных из
агарозных гелей (LGT)1* (без предварительной очистки ДНК). В случае
клонов кДНК инсернионный фрагмент должен быть вырезан до ме-
ченмя.
1. После рестрикции и электрофореза клонированной ДНК2* вырежьте из геля
нужную полоску, взвесьте этот гелевый фрагмент и поместите в пробирку
(Eppendorf).
2. РастЕорите гель и денатурируйте ДНК, поместив пробирку е кипящую воду
на 10 мин.
3. Инкубируйте при 37 °С в течение 10-60 мин. Проведите реакцию мечения,
смешивая компоненты в указанной последовательности:
10.0 мкл буфера для мечения олигонуклеотидов3*
2.0 мкл бычьего сывороточного альбумина (10 мг/мл)
35,5 мкл раствора ДНК/агароза (не более 30 мкл от количества пункта "2"
+ бидистиллированная Н20)
2.0 мкл [32P]-dCTP (20 мкКи) (Amersham, уд. акт. 400 Ки/ммоль)
0,5 мкл фрагмента Кленова (2 единицы) (NBL Enzyme Ltd).
4. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 5-16 ч н затем
добавьте 200 мкг останавливающего раствора [20 мМ NaCl; 20 мМ трис-НС1 pH
7,5; 2 мМ ЭДТА; 0,25% (в/о) ДСН; 1 мкМ dCTP].
5. Проведите экстракцию фенолом один раз, затем водный слой трижды
экстрагируйте эфиром, добавьте 10 мкг ДНК сонированной спермы лосося и
проведите экстракцию этанолом, прибавив 3 объема 96%-ного (о/о) этанола и
0,1 объема 2М раствора ацетата натрия.
6. Отцентрифугируйте в течение 15 мин в микроцентрифуге Eppendorf,
удалите супернатант, высушите осадок и ресуспенднруйте его в 200 мкл
ТЭ1).
7. Прокипятите 5 мин перед гибридизацией.
Б. о'-концевое мечение синтетическими олигонуклеотидами
л'-концы олигонуклеотидов могут быть помечены с помощью полинуклеотид-
киназы Т4 и [y-32P1-ATP. Этот энзим катализирует перенос ^-фосфата от АТР
к б'-концам олигонуклеотида. Приготовьте 50 мкл метящего раствора
следующим образом.
3. Смешайте
I мкг олигонуклеотида 5 мкл десятикратного буфера киназы5*
50 пмоль [^-32Р]-АТР (150 мкКи) (Amersham, уд. акт. 300 Ки/ммоль)
!0 единиц полинуклеотидкиназы Т46*,
довести объем до 50 мкл бидистиллированной водой.
2. Инкубируйте при 37 °С в течение 30 мин.
Предыдущая << 1 .. 96 97 98 99 100 101 < 102 > 103 104 105 106 107 108 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed