Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 99

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 93 94 95 96 97 98 < 99 > 100 101 102 103 104 105 .. 162 >> Следующая

2) На основании данных Пико и Клегга |3), заключивших, что содержание
ро!у(А)+-РНК в 10 раз выше содержания ро!у(А)+ эмбриона.
') Число клонов для создания полной библиотеки оценено как 2ХЮ\ а
количество полнадеиилироваиной РНК приблизительно 0,1 мкг (в зависимости
от эффективности каждою шага процедуры). Детали см. в тексте.
раннего развития (это более чувствительный метод, чем гибридизационный
анализ при переносе);
в) клоны, выделенные из библиотек кДНК, можно использовать для
изучения мультигенных семейств; секвениро-вание даст возможность
безошибочно идентифицировать члены семейства, экспрессирующиеся в данное
время.
Таким образом, библиотеки кДНК эмбрионов представляют ¦собой мощное
средство для изучения молекулярных событий, связанных с ранним развитием.
2. Оценка РНК-носителя
Для преодоления технических трудностей, связанных с необходимостью
манипулировать очень малым объемом материала, должна быть применена
система носителя, сводящая к минимуму потери мРНК и кДНК, которые в
противном случае окажутся непозволительно большими. Подходящий носитель,
используемый при селекции полиаденилированных РНК и последующем синтезе
кДНК, должен удовлетворять нескольким требованиям. Среди них наиболее
существенны следующие:
1) он должен быть полиаденилирован;
2) он должен быть представлен ограниченным числом видов- как можно
меньшим;
3) он не должен иметь последовательностей, общих с анализируемой РНК;
4) вся последовательность РНК-носителя (ей) должна быть известна;
5) носитель не должен иметь преимущества при клонировании.
Этим условиям отвечает геном вируса мозаики вигны (CPMV). Это типичный
представитель комовирусов, инфициру-
Библиотека кДНК дли предимплантационного эмбриона мыши 243
ет он только растения. Его геном состоит из двух одноцепочечных молекул
РНК, обладающих положительной полярностью. Каждая молекула заключена в
капсид. Эти РНК имеют разные размеры: большая состоит из 5889, а меньшая
- из 3481 нуклеотида. Обе РНК полиаденилированы [16J, что необычно для
вирусов растений, определена их полная последовательность [17, 18J. Таким
образом, требования 1, 2 и 4, предъявляемые к носителям, соблюдены.
Пробный эксперимент клонирования, в котором РНК CPMV была смешана с РНК
печени мыши в весовом отношении 9: 1, выявил, что с радиоактивным зондом
РНК CPMV было гибридизовано приблизительно в 9 раз больше бляшек, чем с
зондом РНК печени мыши, и что ни одна бляшка с обоими зондами не
гибридизуется [19]. Следовательно, требования 3 и 5 также соблюдены.
Итак, РНК CPMV по всем критериям подходит на роль носителя и должна быть
с успехом использована в экспериментах с клонированием кДНК.
3. Сбор ооцитов и эмбрионов и выделение РНК
Суперовуляция самок мыши описана в разд. 5.4 гл. 1, а сбор ооцитов и
предимплантационных эмбрионов описан в разд. 2 гл. 2. Поэтому мы не будем
подробно останавливаться на этих процедурах, а сфокусируем все внимание
на специальной проблеме выделения РНК.
Следует обратить внимание на необходимость соблюдения стерильности при
сборе ооцитов и эмбрионов. Важно также предотвратить вероятность
загрязнения рибонуклеазой.
3.1. Сбор ооцитов
Для получения количества РНК, достаточного для создания полной библиотеки
ооцита, требуется около 16000 ооцитов (от ~600 суперовулировавшнх, но не
спаривавшихся самок мыши) (см. табл. 9.1). Существенным условием
получения хорошей"! библиотеки служит предупреждение деградации РНК,
поэтому сбор ооцитов необходимо проводить очень быстро. Ооциты с
аномальными признаками следует отбрасывать. Особенно важно отделить от
ооцита клетки кумулюса, которые, являясь по происхождению материнскими,
могут внести в библиотеку ненужную информацию. Ооциты, лишенные клеток
кумулюса, отмойте в среде М16 без БСА (гл. 2, разд. 5) и поместите их г.
2 мкл среды в пробирку (Eppendorf) на 1,5 мл. Судя по нашему опыту,
удобно собрать 8000 ооцитов в одну пробирку, немедленно заморозить в
жидком азоте и хранить при -70 °С. Исключительно важно, чтобы весь период
времени между сбо-
16*
244
Глава 9
Таблица 9.2. Выделение тотальной РНК
1. Разморозьте образцы на льду и немедленно добавьте 100 мкл буфера для
экстракции (БЭ)'>. Перемешайте пипетироваииемг-дважды втянув и выпустив
из пипетки.
2. Добавьте 10 мкл БЭ, содержащего 0,1% ДСН (в/о), затем 100 мкл забу-
ференного фенола2*.
3. Добавьте еще по 0,5 мл БЭ и фенола. Воспользуйтесь вортексом
(кратковременно) и фракционируйте центрифугированием в микроцентрифуге в
течение 5 мин.
4. Отберите водную фазу (учтите, что поверхность раздела очень мала) и
вновь экстрагируйте фенольную фазу 100 мкл БЭ. Слейте водные фазы.
5. Удалите оставшиеся следы фенола встряхиванием с равным объемом
водонасыщенного эфира (трижды сменив его) или до просветления водной
фазы.
43. ДНК можно удалить на этом этапе путем воздействия РНКаза-свободиой
ДНКазой3*. Добавьте 350 мкл трехкратного буфера RQ14), а затем 10 единиц
ДНКазы. Проинкубируйте при 37 °С в течение 10 мин.
Предыдущая << 1 .. 93 94 95 96 97 98 < 99 > 100 101 102 103 104 105 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed