Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 100

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 94 95 96 97 98 99 < 100 > 101 102 103 104 105 106 .. 162 >> Следующая

7. Внесите равный объем фенола и повторите экстракцию, как в пп. "4"
и "5".
¦8. Осадите РНК, перенеся водную фазу в стерильную силиконовую пробирку
Согех и добавив 2,5 объема холодного абсолютного этанола и 0,1 объема ЗМ
ацетата натрия.
9. Храпите при -20 °С всю ночь.
.10. Соберите осажденную РНК центрифугированием при 10 000 об/мин в
роторе Sorvall SS 34 в течение 45 мин при 4 °С. Отмойте осадок холодным
70%-ным (о/о) этанолом, высушите под вакуумом и ресуспендируйте в 0,5 мл
стерильной бидистиллированной Н20 температуры льда.
11. Определите количество полученной тотальной РНК с помощью
спектрофотометра, воспользовавшись стерильной автоклавируемой кюветой.
Измерьте отношение А2бо: A2so. Значение 1,8-2,0 указывает на то, что
препарат нуклеиновой кислоты свободен от белка, но значение отношения
1,7-1,8 также допустимо. По измерению Ажо сделайте оценку тональной РНК
(для РНК 1 ОП=40 мкг/мл).
М БЭ: ОД М NaCt; 0,001 М ЭДТА; 0,02 М трис-НС[ pH 7.4.
-> См. [26].
ДНКаза (продукт RQ1ТМ) поставляется Promega Biotech. I единица фермента
необходима для полной деградации I мкг ДНК в течение 10 мин при 37 "С.
4) Трехкратный буфер RQ1: 120 мМ трис-НС1 pH 7,9; 30 мМ MgCI,.
ром ооцитов и экстракцией нз них РНК они оставались замороженными,
поскольку оттаивание клеток привело бы к их лизису, высвобождению
эндогенных рибонуклеаз и деградации
РНК.
3.2. Сбор предимплантационных эмбрионов
Этот материал соберите так, как описано в разд. 2, гл. 2. Отбросьте все
отстающие в развитии или морфологически аномальные эмбрионы. Поскольку
сбор образцов занимает много времени, единовременно собранную порцию
следует ограничить примерно 1000 эмбрионов. Каждую порцию отмойте в среде
Библиотека кДНК для предимплантационного эмбриона мыши 245
М16 без БСА и поместите в пробирку (Eppendorf) в минимальном объеме среды
(как в случае ооцитов). Немедленно заморозьте в жидком азоте и храните
при -70°С, пока не наберется количество материала, достаточное для
экстракции РНК-
3.3. Выделение РНК
Нуклеиновую кислоту следует выделять из ооцитов и эмбрионов
модифицированным методом Брауде и Пелхэма [20] (табл. 9.2). При этом
важно не добавлять тРНК-носителя, так как он содержит небольшие
количества двухцепочечной ДНК, которая впоследствии будет клонирована.
3.4. Селекция poly (А)+РНК и добавление носителя
Исходя из уровня тотальной РНК (табл. 9.2), рассчитайте количество poly
(А)+-РНК (см. табл. 9.1). Внесите достаточное количество РНК-носителя
CPMV, чтобы в сумме получился 1 мкг полиаденилированной РНК.
Полиаденилированную РНК можно выделить либо хроматографически на
oligo(dt)-целлюлозе (Тип 3, Collaborative Research), либо с помощью
бумаги для аффинного связывания РНК (Hybond(tm)-mAP, Amersham). Последний
метод рекомендуется для малых количеств РНК. При этом следует изменить
пропись изготовителя, включив дополнительную отмывку в 0,1М NaCI в
течение 5 мин перед промывкой в 70%-ном (о/о) этаноле.
4. Конструирование библиотек
Методы конструирования библиотеки кДНК детально описаны в предыдущем томе
этой серии [21] и поэтому здесь не приводятся. Наше внимание будет
сосредоточено на манипулировании очень малыми объемами исходного
материала.
4.1. Выбор вектора
В последнее время для создания библиотек кДНК вместо плазмидных векторов
начинают все шире применяться векторы на основе фага лямбда, что
объясняется следующими причинами.
1. Лямбда-векторы обеспечивают очень высокую эффективность
клонирования благодаря упаковке in vitro. В настоящее время можно
приобрести превосходные экстракты, улучшающие упаковку. Поскольку
эффективность клонирования кДНК зависит от эффективности упаковки,
246
Глава 9
при наличии очень малых количеств кДНК следует пользоваться лучшими из
имеющихся экстрактов.
2. Скрининг фаговых бляшек на нитроцеллюлозных фильтрах с помощью зондов
нуклеиновых кислот является более чувствительным и воспроизводимым
методом, чем гибридизация бактериальной колонии. Это обстоятельство
становится особенно существенным при проведении дифференциального
гибрндизационного анализа.
3. Если используется иммунный вектор, несущий вставку, такой как XgtlO
или NM 607, нерекомбинантные молекулы могут быть элиминированы из
библиотеки введением в соответствующий штамм Escherichia coli.
Для создания библиотек кДНК выбран фаг ^gtlO [23]. Это хорошо
размножающийся фаг, образующий крупные однородные бляшки, что немаловажно
для дифференциального скрининга. С помощью этого вектора можно
клонировать любые фрагменты кДНК размером до 7,6 т. п. н. Большинство
эукариотических мРНК относится именно к этому классу. Если требуются
копии очень длинных РНК, таких, как РНК ламина В2 (8 т. п.н.), лучше
использовать другой фаговый вектор - NM1149 [24], способный включать
последовательности большего размера. В тех случаях, когда доступен только
метод скрининга, использующий зонды антител, узнающих белок,
закодированный кДНК, молекулы кДНК должны быть клонированы в таком
Предыдущая << 1 .. 94 95 96 97 98 99 < 100 > 101 102 103 104 105 106 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed