Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
3. Тест на реакцию «трансплантат против хозяина», основанный на подсчете «бугорков» на хориоаллантоисной мембране
Помимо уже описанных способов реакции «трансплантат против хозяина» можно количественно оценить подсчетом «бугорков», образующихся на хориоаллантоисной мембране зародыша после введения в яйцо суспензии аллогенных клеток. Этот метод отнимает больше времени, чем методика оценки спленомегалии, но дает дополнительную информацию о числе клеток донора, индуцированных к аллогенной реакции, и об интенсивности этой реакции (крупные бугорки образуются при антигенных различиях по МНС, тогда как мелкие — при других антигенных различиях) (Burnet, Boyer, 1961; Longenecker et al., 1970). Число бугорков, которые образуются при данной комбинации донора и хозяина (как и степень спленомегалии), зависит от того, какие линии конкретно используют (Longenecker et al., 1970).
Скорлупу яйца 11-суточного зародыша просверливают в двух местах: над воздушной камерой и посредине длинной оси яйца. При этом хориоаллантоисная мембрана провисает, отслаиваясь от подскорлуповой оболочки (если этого не происходит, то резиновой грушей осторожно подсасывают воздух через отверстие в воздушной камере). Лимфоциты донора (например, 100 мкл, 5-105 клеток) наносят (используя туберкулиновый шприц и иглу № 26) прямо на хориоаллантоисную мембрану. Однако если при сверлении мембрана была повреждена, то лучше перевернуть яйцо, просверлить отверстие над провисшей неповрежденной мембраной и ввести лимфоциты через это третье отверстие. После инъекции отверстие заклеивают клейкой лентой и переносят яйца обратно в инкубатор в строго горизонтальном положении. В инкубаторе яйца выдерживают
Зародыши птиц в иммунологии
433
4—5 сут без переворачивания. Затем удаляют хориоалланто-исную мембрану (разбивают скорлупу вместе с подскорлуповой оболочкой в зоне воздушного мешка), пинцетом вытаскивают зародыш и неповрежденный желточный мешок, обрезают их соединения с хориоаллантоисной мембраной и переносят ее на поверхность ЗФР (10 мл), налитого в чашку Петри диаметром 10 см. Бугорки на мембране подсчитывают невооруженным глазом или с помощью стереомикроскопа с малым увеличением (Longenecker et al., 1970).
И. Парабиоз
Если хориоаллантоисные мембраны двух зародышей птиц привести в соприкосновение, то между кровеносными сосудами образуются анастомозы, кровоснабжение становится общим, а зародыши — парабиотическими. У перепела этого легко достигнуть, вылив содержимое двух оплодотворенных 2-суточ-ных яиц в скорлупу опорожненного куриного яйца (Le Douarin, Coltey, Guillemot, неопубликованные данные). Для получения куриных парабионтов мы предлагаем модифицированный метод Гашека и Грабы (Hasek, Hraba, 1955). С его помощью было показано, что лимфоциты фабрициевой сумки кур происходят из циркулирующих, а не локальных предшественников (Moore, Owen, 1965). Для определения происхождения клеточных типов у парабиотических партнеров в качестве маркеров могут быть использованы половые хромосомы (гл. 22). Для этих же целей можно применять и другие маркеры, такие как антигены групп крови и гистосовместимости или другие лимфоцитарные аллоантигены.
Яйца, инкубированные 8—12 сут, просвечивают и в районе острых концов отмечают кружком (1 см в диаметре) участок над краем хориоаллантоисной мембраны, богатый разветвляющимися кровеносными сосудами. Это место протирают 70%-ным раствором этанола и высверливают скорлупу по периферии отмеченного кружка (соблюдая осторожность, чтобы не повредить мембраны под скорлупой). На высверленную поверхность наносят каплю смеси пенициллина и стрептомицина. Осторожно снимают высверленную скорлупу, на открытую подскорлупо-вую оболочку наносят еще одну каплю раствора антибиотиков и осторожно протыкают ее пинцетом с заостренными концами. После отделения этой оболочки от хориоаллантоисной мембраны часть ее, расположенную против отверстия (кружок диаметром 1 см), отрывают и проверяют целостность хориоаллантоисной мембраны (яичный белок не должен вытекать). Те же манипуляции проделывают со вторым яйцом. Приводят в контакт обнаженные мембраны обоих яиц и вокруг участка кон-
434 Глава 23
такта двух яиц кисточкой наносят расплавленный воск (для этой цели подходит смесь пчелиного воска и парафина 1:1). После того как воск застывает, яйца инкубируют обычным способом; направление переворачивания яиц должно быть перпендикулярно оси, соединяющей их центры. Выживаемость па-рабиотических пар достигает 40%.
К. Пересадки тимуса и фабрициевой сумки зародышей
1. Идентификация и удаление тимуса птиц до его колонизации
Тимус у птиц развивается из 3-го и 4-го глоточных карманов. Лимфоидные стволовые клетки (ЛСК) проникают в эпите-лиомезенхимальный зачаток этого органа на 6,5-е и 5-е сутки инкубации у кур и перепелов соответственно (Le Douarin, Jotereau, 1975). Следовательно, до этих сроков можно получить зачаток тимуса без лимфоидных клеток. При его пересад-
Рис. 23-2. Ферментативное отделение тимусно-глоточной энтодермы. У зародыша на стадии 15—20 сомитов вырезают вевтролатеральную часть глотки (Л) и выделяют глоточную энтодерму путем обработки трипсином кардиальной складки (Б, заштрихованная область). 1 — желудочек сердца.
