Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
ке в другой зародыш развивается тимус, в котором эпителиальная строма принадлежит донору, в то время как лимфоциты, макрофаги и дендритные клетки происходят из клеток хозяина (Le Douarin, Jotereau, 1975; Oliver, Le Douarin, 1984).
Для уточнения роли энтодермы в дифференцировке тимуса можно пересаживать чистую глоточную энтодерму (Le Douarin, Jotereau, 1975): на стадии 15—20 сомитов вычленяют вентрола-теральную стенку глотки, включая 3-й и 4-й глоточные карма-яы (рис. 23-2, А), и обрабатывают ее 0,2%-ным трипсином на
А
Б
Зародыши птиц в иммунологии
435
растворе Тироде без Са2+ и Mg2+ в течение 20—30 мин и при 0°С. Гидролиз трипсином позволяет отделить чистую энтодерму от глоточной мезенхимы (рис. 23-2, Б). После стадии 20 сомитов открывается третья жаберная щель и, таким образом, становится невозможным отделить энтодерму тимуса от эктодермальной ткани. Тем не менее эпителиальномезенхимальный зачаток тимуса можно пересадить до его колонизации, взяв для пересадки всю область третьего и четвертого глоточных карманов вместе с жаберными дугами.
'2. Удаление тимуса на более поздних стадиях развития
Зачаток тимуса можно идентифицировать и аккуратно иссечь, начиная с 6-х суток инкубации у кур и 5-х суток у перепела. В это время тимус представлен двумя небольшими тяжами
Рис. 23-3. Схематическое изображение зачатка тимуса зародышей кур на 6-е (А) и 7-е (Б) сутки инкубации. Т3 и Т4 — эпителиальные тяжи, образующиеся из 3-го и 4-го глоточных карманов соответственно; П — паращитовидная железа.
(Т3 и Т4 соответственно), берущими начало из третьего и четвертого глоточных карманов (рис. 23-3, /4). Они быстро сливаются в единый тяж, который растет вдоль яремной вены (рис. 23-3, Б). Каждый тимусный тяж в дальнейшем подвергается сегментации на семь долей.
3. Удаление зачатка фабрициевой сумки
Фабрициева сумка возникает как дорсальный энтомезо-дермальный дивертикул клоаки. У зародышей кур, начиная с двенадцатых суток инкубации, пролиферация энтодермаль-
436 Глава 23
ных клеток приводит к образованию эпителиальных зачатков, из которых развиваются фолликулы фабрициевой сумки. Помимо участия в лимфопоэзе фабрициева сумка вовлечена в процесс гранулопоэза, который в зародышевом периоде протекает в ее мезенхимальном компоненте.
У куриного зародыша заселение фабрициевой сумки происходит в результате одной волны миграции гемопоэтических клеток-предшественников в период с 7,5-х до приблизительно
Рис. 23-4. Схема трансплантации зачатка тимуса или фабрициевой сумки в со-матоплевру (/) 3-суточного зародыша птиц. 2 — третий и четвертый глоточные карманы (зачаток тимуса).
14-х суток инкубации (Houssaint et al., 1976). Неколонизиро-ванные трансплантаты фабрициевой сумки, которые содержат ее эпителий, окружающую мезенхиму и клоаку, выделяют из 7-суточного зародыша (рис. 23-4). Колонизированные фабри-циевые сумки можно получить от более поздних зародышей; обычно перед пересадкой их разрезают на несколько кусочков. Для отделения друг от друга двух слоев эмбриональной фабрициевой сумки соответствующий зачаток инкубируют 30— 60 мин в 1%-ном трипсине на растворе Тироде без Са2+ и Mg2+. Базальная мембрана, подстилающая эпителиальный компонент фабрициевой сумки, облегчает отделение энтодермы и развивающихся фолликулов от мезодермы (Houssaint et al., 1976).
ДОНОР
Зачаток
фабрициевой
сумки
Зачаток тимуса
Зародыши птиц в иммунологии
437
4. Пересадка ткамей в зародыш птиц или на хориоаллантоисную мембрану
Пересадка тканей в яйцо птиц может быть выполнена на различных этапах эмбрионального развития. Пересадку в собственно зародыш кур лучше всего делать на 3,5-е сутки инкубации. Пересаживаемый кусочек вставляют в толщу сомато-плевры между двумя почками конечностей, и он, таким образом, получает возможность развиваться в стенке тела. Можно проводить как гистосовместимые трансплантации курица — курица, так и ксеногенные трансплантации. При гистосовместимости донора и реципиента трансплантат не отторгается после вылупления и может быть сохранен на протяжении любого необходимого периода времени. Трансплантация на хориоаллантоисную мембрану имеет тот недостаток, что продолжительность существования трансплантата на ней ограничена, поскольку эта мембрана высыхает за несколько дней до вылупления цыплят. Пересадка на хориоаллантоисную мембрану возможна с 6-х суток инкубации.
Перед пересадкой ткани яичную скорлупу реципиента протирают этанолом и загнутыми ножницами вырезают в ней кружок диаметром 1,5 см над воздушным мешком. На подскорлу-повую оболочку поверх места трансплантации наносят маленькую каплю физиологического раствора. Острым пинцетом проделывают маленькое отверстие в подскорлуповой оболочке. Физиологический раствор проникает через это отверстие и оттесняет зародыш или хориоаллантоисную мембрану, предотвращая тем самым их повреждение во время последующих операций. При пересадке ткани в 3-суточный куриный зародыш разрезают амнион вдоль цефалокаудальной оси, захватывают и оттягивают один его край тонким пинцетом, глазными ножницами (для иридэктомии) делают небольшой разрез в сома-топлевре и вставляют в него трансплантат, предварительно помеченный порошком животного активированного угля. Затем отверстие в скорлупе заклеивают липкой лентой и яйцо помещают в инкубатор. При пересадке на хориоаллантоисную мембрану трансплантат переносят на мембрану с помощью тонкого пинцета или пипетки с резиновым шлангом, разрезают хориоаллантоисную мембрану в месте Y-образного разветвления кровеносных сосудов и вводят в разрез кусочек ткани, пользуясь гладкой иглой. Разрез заклеивают липкой лентой и инкубируют яйцо, как обычно.
