Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
10. Поместить в кювету капилляр с образцом в IX CAS, закрыть крышку и записать результат.
24. Количественное определение ДНК человека в растворе с помощью тест-набора QuantiBlot
Human DNA Quantitation Kit
Тест-наборы QuantiBlot® Human DNA Quantitation Kit, производства фирмы Applied Biosystems, используются для быстрого определения малых количеств человеческой ДНК. В данных тест-системах реализован метод, основанный на гибридизации биотинилированного олигонуклеотида (5'-биотин-TAGAAGCATTCTCAGAAACTA СТТТ GT G AT G ATT С ATT С -31) с образцами ДНК, иммобилизованными на нейлоновой мембране. Данный олигонуклеотид комплементарен специфичной для приматов последовательности альфа сателлитной ДНК локуса D17Z1, который повторяется от 500 до 1000 раз в 17-й хромосо-
ме. Дальнейшее связывание с биотином конъюгата пероксидазы со стрептавидином позволяет проводить калориметрическую детекцию иммобилизованной ДНК, путем окисления 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (рис. 21). С помощью этого метода можно визуально определить от 10 до
0,15 нг ДНК человека.
ХРОМОГЕН ОКИСЛЕННЫЙ '
(ТМВ) ПРОДУКТ
Рисунок 21. Определения малых количеств человеческой ДНК методом гибридизации биотинилиро-ванного олигонуклеотида с образцами иммобилизованной ДНК. Визуализация образовавшегося ассо-циаты происходит путем связывания с биотином конъюгата Пероксидазы хрена со Стрептавидином и дальнейшего окисления хромогена ТМВ.
ОБРАЗЕЦ:
экстракт ДНК, полученный с помощью различных методов, включая Chelex 100 и фенол-хлороформ.
Иммобилизация ДНК на мембране
1. Приготовить разведения стандартного раствора ДНК (2 нг/мкл) в ТЕ-буфере, как указано ниже.
Про Концентрация, Количество
бирка нг/мкл ДНК
в 5 мкл, в нг
А 2 10
В 1 5
С 0,5 2,5
D 0,25 1,25
Е 0,125 0,625
F 0,0625 0,3125
G 0,03125 0,15625
2. Поместить 200 мл раствора для гибридизации и 500 мл Отмывающего раствора в термостат на +50°С. Выдержать не меньше 1 часа.
3. Сделать роспись количества исследуемых образцов, включая дважды по семь стандартов ДНК человека (А-G), два стандарта
(0,7 нг/мкл — контроль 1 и 0,1 нг/мкл — контроль 2) и одну холостую пробу (только Покрывающий раствор). При использовании слот-блот аппарата (полоски) максимальная загрузка мембраны не превышает 48 образцов (вместе со всеми стандартами и контролями).
4. Подготовить необходимое количество 1,5 мл пробирок. В каждую пробирку внести по 150 мкл Покрывающего раствора.
5. В соответствующие пробирки с Покрывающим раствором внести по 5 мкл каждого стандарта, контроля 1, контроля 2, холостой пробы.
6. В соответствующие пробирки с Покрывающим раствором внести по 1-5 мкл исследуемых растворов ДНК (Исследуемые пробы не должны содержать МдС12). Записать объем внесенного раствора ДНК.
7. Надеть чистые перчатки и вырезать фрагмент Biodyne В мембраны размером
11 см х 7,9 см. На верхнем левом углу поставить дату и инициалы.
8. Мембрану поместить в специальную емкость для проведения гибридизации, содержащую 50 мл Предварительно смачивающего раствора.
9. Инкубировать при комнатной температуре от 1 до 30 минут.
10. Пинцетом вытащить мембрану из Предварительно смачивающего раствора и поместить (подписанной стороной наверх)
на прокладку блоттинг-аппарата (рис. 22). Собрать прибор. Включить вакуумный насос. Перекрыть клапан sample, открыть с1атр-клапан.
Clamp-
вакуум
ample-
вакуум
Рисунок 22. Внешний вид Слот-блоттинг аппарата The Convertible®Filtration Manifold
System (GIBCO BRL)
11. Слить Предварительно смачивающий раствор из емкости для гибридизации, емкость тщательно промыть деионизованной водой.
12. Внести в соответствующие лунки блот-аппарата по 155 мкл каждого стандарта и исследуемых образцов. Образцы должны заноситься в следующем порядке: 1-я колонка — стандарты А-G и холостая проба,
2-я колонка — контроль 1, контроль 2, затем — исследуемые образцы, в лунки последней колонки повторно внести стандарты A-G.
13. После внесения всех образцов медленно открыть sample-клапан. Оставить sample-клапан открытым до тех пор, пока все образцы не пройдут через мембрану (приблизительно 30 секунд).
14. Перекрыть клапаны sample и clamp. Отключить вакуумный насос.
15. Разобрать блот-аппарат и извлечь мембрану. Не позволять мембране высохнуть. После каждого использования промыть блоттинг-аппарат 0,1% раствором SDS.
ДНК гибридизация
16. Перенести мембрану в емкость для проведения гибридизации, содержащую 100 мл предварительно нагретого раствора для гибридизации. Добавить 5 мл 30% перекиси водорода. Инкубировать на водяной бане-шейкер при +50°С (±1°С) при 50-60 об/мин. в течение 15 мин. (±2 мин.). После инкубации раствор слить.
17. Добавить 30 мл предварительно нагретого до +50°С Гибридизационного раствора и
