Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
VI. КАЧЕСТВЕННАЯ И КОЛИЧЕСТВЕННАЯ
ОЦЕНКА ВЫДЕЛЕННОЙ ДНК
Для определения концентрации ДНК в растворе широко используются 3 метода. Наиболее простым и точным является спектрофотометрический метод, однако он обладает сравнительно малой чувствительностью. Однако, если содержание сумарной фракции ДНК невелико, концентрацию ее можно определить по интенсивности флуоресценции ее комплексов с бромистым этидием или бисбензимидом (Н33258), либо методом гибридизации со специфичным олигонуклеотидом. В таблице 6 представлены данные по чувствительности и специфичности спектрофотометрического и флуориметрическо-го методов анализа нуклеиновых кислот.
Таблица 6
Показатели спектрофотометрического поглощения и флуоресценции растворов ДНК и РНК
Свойства Поглощение Флуоресценция
Н33258 EtBr
Чувствительность
(мкг/мл)
ДНК 1-50 0,01-15 0,1-10
РНК 1-40 незначительная 0,2-10
Соотношение флуоресц.
сигнала
(ДНК/РНК) 0,8 400 2,2
22. Спектрофотометрическая детекция
нуклеиновых кислот
Концентрацию нуклеиновых кислот в растворе можно рассчитать, измерив его оптическую плотность при 260 нм. Одна единица оптической плотности примерно соответствует концентрации двухцепочечной ДНК 50 мкг/мл и концентрации одноцепочечной ДНК и РНК 40 мкг/мл. По оптической плотности растворов при 260 нм не возможно судить о наличии одно — или двухцепочечных форм нуклеиновых кислот, а также о белковых загрязнениях. Для оценки степени очистки образцов ДНК от белковых примесей можно использовать отношение между оптической плотностью при 260 и 280 нм. Для чистых препаратов ДНК и РНК оно должно быть равно соответственно 1,8 и 2. Если это отношение меньше, значит, препараты загрязнены белками или фенолом, и оценка концентрации будет неверна. В этом случае необходимо повторить обработку протеиназой К и экстракцию фенолом/хлороформом. Поглощение при 325 нм указывает на наличие в растворе частичек пыли (грязи) или на грязную кювету. Примеси веществ с пептидными связями или с ароматическим ядром, такие, как протеины и фенол, будут поглощать при 230 нм.
Для спектрофотометрического определения содержания и степени чистоты нуклеиновых
кислот можно использовать как одно-, так и двулучевые УФ-спектрофотометры.
Ниже представлена методика спектрофотометрического определения ДНК применительно к однолучевым приборам.
a. В кварцевую кювету внести 1,0 мл 1XTNE буфера (холостая проба). Поместить кювету в однолучевой УФ-спектрофотометр, снять показания при X = 325 нм и занулить инструмент. Извлечь кювету с холостой пробой и поставить кювету, содержащую ДНК. Снять показания.
b. Повторить этапы п. 1 для 280, 260 и 230 нм. Важно, чтобы ДНК была растворена в том же самом растворе, что и в холостой пробе.
c. Можно определить концентрацию (С) ДНК по ее поглощению при 280 нм, используя следующие соотношения:
Агбо
Одноцепочечная ДНК: С (рМ/мкл) =--------
10 х S
Агбо
Одноцепочечная ДНК: С (мкг/мл) =-------
0,027
Агбо
Двухцепочечная ДНК: С (рМ/мкл) =---------
13,2 xS
Агбо
Двухцепочечная ДНК: С (мкг/мл) =-------,
0,020
где S — размер ДНК в тыс. н.п.
Для одноцепочечной ДНК это соотношение рассчитано для 1 см кювет и нейтральных значений pH. Все эти вычисления основаны на законе Бугера-Ламберта-Бера: А = еС1, где А — оптическая плотность, С — концентрация ДНК, 1 — толщина кюветы (обычно 1 см), s — моляр-ный коэффициент экстинции. Если концентрация выражена в моль/литр (толщина кюветы равна 1 см), коэффициент молярной экстинции имеет размерность М^см'1. В случае же, если концентрация выражается в мкг/мл, е имеет размерность (мкг/мл)'1 см1. В нашем случае значения е следующие: для одноцепочечной ДНК: 0,027
(мкг/мл) •см'1, для двухцепочечной ДНК: 0,020 (мкг/мл)'1 см1. Используя приведенные выше формулы, получаем, что одна единица оптической плотности при X = 260 нм соответствует 50 мкг/мл двухцепочечной ДНК и приблизительно 37 мкг/мл одноцепочечной ДНК.
Используя соотношения оптических плотностей А2бо/А28о- а также показания А2зо и А325, можно оценить степень чистоты образца ДНК. Соотношение в пределах 1,8 — 1,9 указывает на высокую степень очистки препаратов ДНК. Наличие белковых примесей, которые поглощают
при А. = 280 нм, приводит к снижению этого соотношения. Поглощение при 230 отражает контаминацию образцов фенолом или мочевиной. Поглощение при 325 нм указывает на наличие в растворе нерастворимых частичек или на грязную кювету, что может сильно завышать поглощение при 260 нм.
