Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
7 мМ раствор NaOCl
При приготовлении необходимо учитывать концентрацию активного хлора.
Растворы для выделения ДНК методом
нуклеосорбции
Лизируюший буфер (ЛБГ)
120 г гуанинтиоционата растворяют в 100 мл 0,1 М трис-HCl, pH 6,4; добавляют 22 мл 0,2 М раствора ЭДТА и 2,6 г Тритона Х-100. Раствор гомогенизируют.
Отмывающий раствор ЮРП
120 г гуанинтиоционата растворяют в 100 мл 0,1 М трис-HCl, pH 6,4. Растворение ускоряют подогреванием до + 60-65°С при перемешивании.
Концентрат элюирующего буфера f 100Х ЭБ):
1 М трис НС1. 0.1 М ЭДТА. pH 8.0. 100 мл
Растворяют 12,1 г триса в 60 мл воды, добавляют 20 мл 0,5 М раствора ЭДТА pH 8,0. концентрированной соляной кислотой доводят pH до 8,0. Доводят объем раствора до 100 мл.
Элюирующий буфер (ЭБ): 10 мМ трис НС1.
1 мМ ЭАТА. pH 8.0
Готовят из стократного концентрированного исходного буфера, автоклавированного при +121°С в течение 20 минут.
Подготовка сорбента SiOo
60 г двуокиси кремния (Sigma, 0,5-10 микрон) суспендируют в 500 мл дистиллированной воды в стеклянном цилиндре и оставляют на 24 часа
при комнатной температуре. Отбирают 440 мл супернатанта и доводят объем до 500 мл дистиллированной водой. Энергично встряхивают и оставляют на 5 часов при комнатной температуре. Удаляют 440 мл супернатанта и прибавляют примерно 600 мкл НС1 (32% вес/объем), чтобы pH сделать равным 2. Полученного количества суспензии сорбента достаточно приблизительно на 1500 экстракций нуклеиновых кислот. Суспензию распределяют по 4 мл в стеклянные флаконы с плотно закрывающимися пробками и автоклавируют 20 минут при +121°С. Сорбент стабилен в течение 6 месяцев при комнатной температуре в темноте.
Растворы для проведения электрофореза
Трис-боратный буфер ГГВЕ). десятикратный раствор (ЮхТВЕ) - 0.89 М трис-борат; 0.025 М
Ыа2ЭАТА (1 л)
Растворяют 108 г триса, 55 г борной кислоты и 9,3 г Na2EDTAx2H20 в дистиллированной воде. Доводят pH до 8,0 титрованием с помощью раствора NaOH. Доводят объем до 1 л. В качестве рабочего раствора используют lxTBE.
Раствор lxTBE fl л)
К 100 мл ЮхТВЕ добавляют 900 мл дистиллированной воды.
0.8 %-ный раствор агарозы на IxTBE-буфере
(100 мл)
Разводят 0,8 г агарозы в 100 мл IxTBE-буфера и доводят до кипения. После охлаждения до 50-70° С в раствор агарозы добавляют бромистый этидий (10 мг/мл) из расчета 5 мкл на 100 мл раствора.
1 %-ный раствор агарозы на IxTBE-буфере
(100 мл)
Разводят 1 г агарозы в 100 мл IxTBE-буфера и доводят до кипения. После охлаждения до 50-70°С в раствор агарозы добавляют бромистый этидий (10 мг/мл) из расчета 5 мкл на 100 мл раствора.
Раствор бромистого этилия. 10 мг/мл (100 мл)
Растворяют 10 мг бромистого этидия в 1 мл дистиллированной воды, размешивая на магнитной мешалке несколько часов. Хранят в темной склянке при температуре 2 - 8°С.
6Х буфер для нанесения проб в гель (1 мл)
Растворяют 2,5 мг бромфенолового синего и 2,5 мг ксиленцианола в 1 мл 30%-ного водного раствора глицерина. Хранят при температуре
2 - 8°С.
Растворы для количественной оценки выделенной ДНК на флуориметре HOEFER
DyNA QUANT™ 200
Раствор красителя Hoechst 33258 (10 мл)
10 мг Н 33258 растворяют в 10 мл деионизованной воды. Не фильтровать. Хранить при +4°С до 6 месяцев.
IPX TNE буфер - 100 мМ триса. 10 мМ
Na23ATA. 2 М NaCl (1 л)
Растворить 12,11 г триса, 3,72 г №2ЭДТАх2Н20 и 116,89 г NaCl в 800 мл деионизованной воды. Концентрированным НС1 довести pH до 7,4. Довести объем до 1000 мл. Перед использованием отфильтровать (0,45 мкм). Хранить при +4°С до
3 месяцев.
Капиллярный 2Х CAS А (раствор для измерения низких концентраций ДНК (до 10 нг/мкл). 1 мл
Смешивают 2 мкл раствора Hoechst 33258, 100 мкл 10Х TNE и 898 мкл деионизованной воды.
Капиллярный 2Х CAS В (раствор для измерения высоких концентраций ДНК (10—100 нг/мкл).
1 мл
Смешивают 20 мкл раствора Hoechst 33258, 100 мкл 10Х TNE и 880 мкл деионизованной воды.
Растворы для количественной оценки ДНК человека методом QuantiBlot гибридизации с использованием тест-набора QuantiBlot Human DNA Quantitation Kit, производства
фирмы Applied Biosystems
Цитратный буфер (0.1 M цитрата натрия.
pH 5.0: 1 л)
Растворяют 18,4 г дигидрата трехзамещенного цитрата натрия (№зСбН50уХ2Н20) в 800 мл деионизованной воды. Доводят pH до 5,0 (±0,2) добавлением примерно 6 г моногидрата лимонной кислоты (СбН807ХН20). Довести конечный объем раствора до 1 л деионизованной водой и тщательно перемещать. Проверить pH.
20Х SSPE буфер (3.6 М NaCl. 200 мМ NaH2POAXH2Q. 20 мМ ЭАТА. pH 7.4: 1 л)
Растворить 7,4 г №2ЭДТАх2Н20 в 800 мл деионизованной воды. Доводят pH с помощью ЮМ NaOH до 8,0 (±0,2). Добавляют 210 г NaCl и 27,6 г NaH2P04XH20. Доводят pH до 7,4 (±0,2) 10 М NaOH (примерно 10 мл). Доводят объем до 1 л деионизованной водой и тщательно перемешивают.
