Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
}'• ’ ;!•
Фильтрат
/
Рисунок 18. Хранение раствора ДНК после концентрирования на Centricon 100.
Литература
1. Kirby L.T. DNA Fingerprinting: an Introduction. New York: Stockton Press, 1992, 366 p.
2. DNA Procedures Manual. Organic extraction of DNA from soft tissue. Ver.2.0 // Armed Forces Institute of Pathology, DNA Identification Laboratory, Washington, 1998, P. 1-3.
3. AmpFlSTR Profiler Plus PCR Amplification Kit. User's Manual. Applied Biosystems, 1998. — P. 3.1-3.41.
4. AmpliType™ User Guide, Version 2; Cetus Corporation: Emeryville, CA; 1990.
5. DNA Procedures Manual. Chelex extraction tissue and fresh bone. Ver.2.1 // Armed Forces Institute of Pathology, DNA Identification Laboratory, Washington, 1995, P. 1-3.
6. Centricon Centrifugal Filter Devices. User Guide. 1999, Millipore Corp.
V. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ФИКСИРОВАННЫХ
ТКАНЕЙ
В судебно-медицинской практике имеют место случаи, когда вещественными доказательствами служат фиксированные ткани — так называемый «мокрый архив».
Ткани лучше всего фиксировать сразу после их получения, однако этот момент не является ключевым. Можно проводить амплификацию ДНК и в том случае, если ткани получены через семь (а возможно, и более) дней после смерти. Приемлемой матрицей для ПЦР является ДНК тканей, фиксированных в 10% забуференном формалине и залитых в парафиновые блоки. Вполне пригодным для ПЦР материалом являются ткани, фиксированные в этаноле или ацетоне и залитые в парафин. Несколько худшие результаты получаются при фиксации тканей фиксаторами Кларка и Замбони, параформальдегидом, формалином/этанолом/уксусной кислотой и совсем непригодны фиксаторы Зенкера, Карнуа, Буэна. Обработка препаратов кислыми растворами, декальцинирующими костную ткань, обычно приводит к деградации ДНК и тем самым препятствует амплификации.
При фиксации ткани в забуференном формалине ДНК взаимодействует с формальдегидом с образованием шиффовых оснований. При увеличении времени фиксации (более 1-3-х суток) ДНК претерпевает необратимые изменения. Тем
не менее в нашей практике имели место случаи успешной амплификации ДНК, выделенной из мягких тканей, которые около года хранились в растворе формалина.
После заливки ткани в парафин стабильность ДНК повышается, однако вследствие ее медленной деградации в очень старых (более 10-летней давности) парафиновых блоках эффективность ферментативной амплификации снижается. Тем не менее в большинстве случаев с помощью ПЦР удается анализировать и 30-летние пара-финизированные препараты, а иногда и археологические образцы.
Залитые в парафин фрагменты тканей можно депарафинировать с помощью ксилола или октана.
20. Депарафинирование фрагментов тканей
1. В стерильную микроцентрифужную пробирку помещают небольшой срез ткани. Добавив
1 мл выбранного растворителя, встряхивают и оставляют при комнатной температуре на
2 минуты. Парафин при этом полностью растворяется.
2. Полученный раствор центрифугируют при 10000-14000 g в течение 5 минут. Супернатант удалить.
3. Добавить 1 мл 95% раствора этанола, встряхнуть.
4. Центрифугировать при 10000-14000 g в течение 5 минут. Супернатант слить.
5. Этапы 3 и 4 повторить еще раз.
6. Осадок ткани высушить на вакуумном концентраторе.
21. Выделение ДНК из депарафинированных
тканей
1. К депарафинированному срезу (2 мм2 и более) добавить 500 мкл лизирующего буфера и 10 мкл протеиназы К (10 мг/мл). Перемешать.
2. Инкубировать 12-14 часов в термошейкере при 37°С.
3. Добавить 500 мкл забуференной смеси фенол/хлороформ/изоамилового спирта (25:24:1). Тщательно перемешать.
4. Центрифугировать 2 минуты при 10000-15000 об/мин.
5. Перенести верхнюю водную фазу (осторожно, не задевая интерфазы) в стерильную микроцентрифужную пробирку.
6. Повторить экстракцию верхней водной фазы равным объемом хлороформ/изоамилового спирта (24:1).
7. Для преципитации ДНК из водной фазы добавить -г- объема 8 М ацетата аммония и равный объем изопропанола.
8. Перемешать, пробирку поместить — 20°С, как минимум, на 1 час.
9. Центрифугировать 10 минут при 15000 об/мин.
10. Декантировать супернатант.
11. Для максимального удаления солей осадок промыть 70% этиловым спиртом.
12. Ресуспендировать осадок ДНК в 10-50 мкл ТЕ при 56°С в течение, как минимум, 1-2-х часов.
13. Оценить количество и качество выделенной ДНК при помощи электрофореза в 0,8-1% агарозном геле. Записать полученный результат.
14. Выделенную ДНК хранить при +4°С в течение 3-х недель, либо при — 70°С неограниченно долго.
Литература
1. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. Под ред. Херрингтона С., Макги Дж. — М.: Мир, 1999. — 558 с.
2. Ancient DNA: recovery and analysis of genetic material from paleontological, archaeological, museum, medical, and forensic soecimens. Eds. Herrmann B., Hummel S. New York, Berlin: Springer, 1994, 264 p.
3. Shimizu H., Burns J.C. Extraction of nucleic acids: sample preparation from paraffin-embedded tissues. In book: PCR strategies. Eds. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J. San Diego: Academic Press, CA, 1995, 370 p.
