Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
3-5 мкл экстракта ДНК.
1. Готовят IxTBE в объеме, достаточном для заполнения камеры для электрофореза и приготовления геля.
2. Добавляют к IxTBE агарозу в количестве, необходимом для получения 0,8 или 1% раствора и нагревают в микроволновой печи до полного расплавления агарозы.
3. Полученный жидкий раствор охлаждают до 50-60°С, добавляют бромистый этидий до конечной концентрации 0,5 мкг/мл и осторожно перемешивают, избегая появления в геле пузырьков воздуха.
4. Теплую агарозу выливают в соответствующую форму и равномерно распределяют ее по кювете. Вертикально вставля-
А
*
ют гребенку, так, чтобы ее зубцы не доставали до дна примерно 1,5 мм.
5. Оставляют кювету с агарозным гелем на 30 минут, затем осторожно удаляют гребенку. Кювету с гелем помещают в элек-трофорезную камеру, содержащую необходимое количество lxTBE.
6. Подготавливают к электрофорезу образцы исследуемой и маркерной ДНК, для чего смешивают их с 6х буфером для нанесения (5:1, о/о). Аккуратно внести образцы в соответствующие лунки геля. Избегать перетекания образцов в соседние лунки.
7. В первую и последнюю лунки нанести маркер молекулярных масс, например, X/EcoRI + Hindlll (рис. 24).
8. Электрофорез проводить при постоянном напряжении (5-7 В/см) в течение 60 минут (до тех пор, пока бромфеноловый синий не дойдет до конца геля).
9. Просматривают гель в УФ-свете на трансиллюминаторе (рис. 25) и фотографируют.
M t”
! Л i 5
—
Рисунок 24. Лямбда ДНК/EcoRI+HindIII маркер в 1 % агарозном геле. После совместной обработки ДНК фага Я рестриктазами EcoRI и Hindlll получаются 13 дискретных фрагментов, размерами 21226', 5148, 4973, 4268, 3530', 2027, 1904, 1584, 1375, 947, 831, 564 пар оснований. Липкие концы размером 12 нуклеотидов cos-сайта бактериофага Я фрагментов 21226 и 3530 могут отжигаться друг на друге и образовывать дополнительные полосы длиной 24756 нуклеотидных пар.
Рисунок 25. Результаты электрофореза суммарной фракции нуклеиновых кислот в 1 % -ой агарозе, экстрагированной по стандартной методике из клеток периферической крови практически здоровых людей (дорожки 2-9), в качестве размерного стандарта использовали ДНК фага X, обработанную рестриктазами EcoRI и HindHI (дорожки 1 и 10). В районе между полосами 21226 и 5148 отчетливо видна фракция митохондриальной ДНК размером 16569 нуклеотидных пар.
26. Фотодокументирование результатов электрофореза в агарозном геле
Визуализация агарозного геля с разделенными фрагментами ДНК, ассоциированными с броми-
стым этидием, возможна как в проходящих, так и в отраженных ультрафиолетовых лучах. Видимое изображение объекта в ультрафиолетовых лучах может быть получено с помощью специализированного прибора — трансиллюминатора, в котором в качестве источника ультрафиолета используют ртутно-кварцевую лампу, перед которой устанавливается фильтр, задерживающий видимые и инфракрасные лучи, но пропускающий ультрафиолетовые лучи с определенной длины волны (как правило, 310-312 нм).
С помощью фотоаппарата, закрепленного на штативе, осуществляют фотосъемку. При фотосъемке с близкого расстояния обычно используют промежуточные кольца, которые устанавливаются между корпусом камеры и объективом. При этом может быть применено или одно кольцо, или комбинация из нескольких колец. Масштаб полученных снимков будет зависеть от длины и количества применяемых колец. При работе с объективами, оснащенными механизмом «прыгающей диафрагмы» и не имеющими ручной установки диафрагмы, необходимо применять промежуточные кольца с толкателем диафрагмы объектива.
Фотографирование оранжевых полос ассо-циатов ДНК с интеркалирующим красителем — бромистым этидием производится только с помощью желтых, оранжевых или красных светофильтров (табл. 8).
Таблица 8
Подбор светофильтров для выявления различий
в окраски объекта
Цвет объекта Фильтр
Фиолетовый Фиолетовый, синий, рубиново
красный
Синий Синий, фиолетовый, голубой
Г олубой Голубой, синий, зелено-голубой
Зелено-голубой Зелено-голубой, голубой, зеленый
Зеленый Зеленый, зелено-голубой, желто-
зеленый
Желтый Желтый, оранжевый, желто-
зеленый
Оранжевый Оранжевый, желтый, красный
Красный Красный, рубиново-красный, оран
жевый
Рубиново Рубиново-красный, красный, фио
красный летовый
Желто-зеленый Желто-зеленый, зеленый, желтый
Снимки агарозных гелей, окрашенных бромистым этидием, в ультрафиолетовых лучах обычно малоконтрастны, поэтому фотографировать следует на контрастные фотоматериалы,
При фотографировании в ультрафиолетовых лучах невозможно оценить яркость объекта, так как она не совпадает с яркостью предмета в видимых лучах спектра, поэтому точная величина выдержки и диафрагмы устанавливается опытным путем.
