Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
15. Выделение ДНК из фрагментов сухожилий, хряща и мягких тканей методом экстракции
органическими реагентами
ПРИНЦИП:
Процедура включает в себя этапы выделения ДНК из сухожилий, фрагментов хрящей и мягких тканей с использованием органических растворителей. Основной этап состоит из лизиса клеток и деградации белковых молекул с последующей серией отмывок смесью фенол/хлоро-форм/изоамиловый спирт. ДНК получают преципитацией с использованием холодного этанола, а затем растворяют в ТЕ-буфере.
ОБРАЗЕЦ:
приблизительно 2-5 мм2 сухожилия, хряща или мягкой ткани, например скелетной мышцы.
1. Стерильными скальпелем или ножницами выделить фрагмент ткани размером приблизительно 2-5 мм2 и поместить его в
1,5 мл стерильную, подписанную микро-центрифужную пробирку типа Эппен-
дорф.
2. Добавить 400 мкл лизирующего буфера и 40 мкл протеиназы К (10 мг/мл). Перемешать.
3. Инкубировать 12-14 часов в термошейкере при 5б°С.
4. Добавить 400 мкл смеси фенол/хлоро-форм/изоамилового спирта (25:24:1). Тщательно перемешать.
5. Центрифугировать 2 минуты при 10000-15000 об/мин.
6. Перенести верхнюю водную фазу (осторожно не задевая интерфазы) в стерильную микроцентрифужную пробирку.
7. Повторить, до тех пор, пока интерфаза не станет чистой.
8. К водной фазе добавить 1,0 мл холодного 96% этанола.
9. Перемешать, пробирку поместить в холодильник на — 20°С как минимум на 30 минут.
10. Центрифугировать 15 минут при 15000 об/мин.
11. Декантировать супернатант.
12. Промыть осадок 1 мл холодным 70% этиловым спиртом.
13. Центрифугировать 5 минут при 15000 об/мин.
14. Супернатант декантировать. Автоматической пипеткой удалить остатки этанола.
15. Осадок высушить при комнатной температуре в течение 30-60 минут.
16. Растворить осадок ДНК в 50 мкл ТЕ при 56°С в течение, как минимум, 2-х часов.
17. Оценить количество и качество выделенной ДНК при помощи электрофореза в
0,8-1% агарозном геле. Записать полученный результат.
18. Вы деленную ДНК хранить при +4°С в течение 3-х недель, либо при — 70°С неограниченно долго.
Примечание. В случае образцов, содержащих меньше чем 500 нг ДНК, рекомендуется проводить концентрирование с помощью Centricon 100.
16. Выделение ДНК из мягких тканей с помощью ионообменной смолы Chelex 100
ПРИНЦИП:
Основная процедура выделения включает в себя очистку от металлосодержащих соединений
и протеинов путем кипячения образца в присутствии Chelex 100, затем лизат непосредственно добавляют в ПЦР смесь.
ОБРАЗЕЦ:
приблизительно 2-5 мм2 мягкой ткани, например, скелетной мышцы или костного мозга.
1. Стерильными скальпелем или ножницами выделить фрагмент мягкой ткани размером приблизительно 2-5 мм2 и поместить его в 1,5 мл стерильную, подписанную микроцентрифужную пробирку типа Эп-пендорф.
2. Добавить 200 мкл 5% взвесь Chelex 100. При отборе взвесь должна быть однородной. Для этого во время отбора ее перемешивают на магнитной мешалке. Использовать наконечники к автоматическим пипеткам с широким отверстием.
3. Инкубировать при температуре 5б°С в течение 30 минут.
4. Перемешать на вортексе в течение 5-10 секунд.
5. Инкубировать в кипящей водяной бане в течение 8 мин.
6. Перемешать на вортексе в течение 5-10 секунд.
7. Центрифугировать в течение 3 минут при 10000 об/мин.
8. Для постановки ПЦР используют супернатант. ДНК, очищенная с помощью Che-
lex 100, является одноцепочечной, поэтому оценить количество и качество выделенной ДНК при помощи методов, где используются интеркалирующие красители, например, бромистый этидий нельзя.
9. Остатки супернатанта хранят при температуре 2-8°С или при -20°С (длительное хранение).
10. При повторном использовании производят действия, указанные в пп. 9-11.
17. Выделение ДНК из мягких тканей
с помощью ионообменной смолы Chelex 100
и протеиназы К
ПРИНЦИП:
Основная процедура выделения включает в себя инкубацию биологического образца с про-теиназой К. Дальнейшую очистку от металлосодержащих соединений и протеинов проводят путем кипячения образца в присутствии Chelex 100. Лизат непосредственно добавляют в ПЦР смесь.
ОБРАЗЕЦ:
Приблизительно 2-5 мм2 мягкой ткани, например скелетной мышцы.
1. Стерильными скальпелем или ножницами выделить фрагмент мягкой ткани разме-
ром приблизительно 2-5 мм2 и поместить его в 1,5 мл стерильную, подписанную микроцентрифужную пробирку типа Эппендорф.
2. В каждую пробирку добавить по 1000 мкл деионизованной воды.
3. Инкубировать 15 минут при комнатной температуре. Встряхнуть.
4. Центрифугировать 5 минут при 10 ООО
об/мин.
5. Удалить 980 мкл супернатанта.
6. В каждую пробирку добавить по 150 мкл 5% суспензии Chelex 100 и по 50 мкл раствора протеиназы К (2 мг/мл). Когда отбирают Chelex, взвесь должна быть однородной. Для этого во время отбора суспензию Chelex необходимо перемешивать на магнитной мешалке. Использовать наконечники к автоматическим пипеткам с широким отверстием.
